ESQUEMA ENZIMAS

PRINCIPALES TÉCNICAS HISTENZIMOLÓGICAS

INTRODUCCIÓN

Acetilcolinesterasa (Ache)

Deshidrogenasa succínica

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Fosfatasa ácida

2NADH

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Fosforilasa

Fosfatasa alcalina

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Citocromo c oxidasa (COX)

ATPpasa a ph 4.5 y 9.4

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PRINCIPALES TÉCNICAS HISTENZIMOLÓGICAS

Las enzimas nos se perciben con los métodos histológicos convencionales (tinciones), pero pueden ser detectadas al actuar como catalizadores de reacción químicas, pues la acción de la enzima sobre un sustrato adecuado produce una sustancia opaca, insoluble y coloreada, visible al microscopio.

PRODUCTO PRIMARIO DE REACCIÓN (PPR):

POST COPULATIVO

CAPTURA SUMULTÁNEA

Puede ser opaco, coloreado e insoluble, pudiéndose ver así al microscopio

El PPR puede no ser opaco, incoloro y soluble, por lo que no se vería al microscopio y habría que añadirle otra sustancia o cromóforo (reactivo de captura), formándose el cromógeno, y bajo la acción de este reactivo la enzima daría lugar al producto final de reacción (PFR) que se vería al microscopio.

Acetilcolinesterasa

La colinesterasa es una enzima crucial para la transmisión nerviosa en las uniones neuromusculares. La colinesterasa hidroliza la acetilcolina en ácido acético y colina, lo que pone fin a la transmisión nerviosa colinesterasa a lo largo de la sinapsis de las uniones neuromusculares. En el cuerpo humano se han clasificado dos variantes de colinesterasa en función de su preferencia por los sustratos la acetilcolinesterasa (AChE) y la pseudocolinesterasa (PChE).

La función principal es hidrolizar al neurotransmisor acetilcolina. Desempeña un papel importante en la función de las uniones neuromusculares periféricas. Sirve para enviar mensajes a otras células, incluso otras células nerviosas, células musculares y células glandulares. Se libera por la terminación del nervio y lleva señales a las células que se encuentran al otro lado de una sinapsis.

https://gredos.usal.es/bitstream/handle/10366/119453/Enzimologia.pdf?sequence=1&isAllowed=y

FUNDAMENTO

Las actividades acetilcolinesterasa se valoran por el método espectrofotométrico de Ellman. Se valora el sustrato de la acetiltiocolina (ATCh) para la actividad AChE y la butiriltiocolina (BuTCh) para la BuChE. Las enzimas AChE y BuChE hidrolizan a los tioanálogos de sus sustratos preferentes y producen acetato y tiocolina. La tiocolina reacciona rápidamente con el ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico y libera un cromógeno, el anión 5,5’-tio-2- nitrobenzoato. Este anión muestra un color amarillo intenso/marrón y un máximo de absorbancia a 412 nm (ε=1,36·104 M-1 ·cm-1 ). Esta circunstancia permite seguir la aparición de tiocolina en el medio de reacción, mediante un colorímetro o espectrofotómetro.

FOSFATASA ÁCDIA

Hidroliza una gran cantidad de fosfomonoésteres, y también es capaz de catalizar transfosforilaciones, al igual que la fosfatasa alcalina. La principal diferencia con ésta radica en su pH óptimo, que está entre 5 y 6, y de ahí su nombre. Se conocen varias isoenzimas de la fosfatasa ácida: las isoenzimas S y F del hematíe o fosfatasa ácida lisosómica o fosfatasa ácida tartrato-resistente (aumenta en determinados estados patológicos por ejemplo en la enfermedad de Hodgkin o ciertas leucemias linfocíticas) y la ACPP o fosfatasa ácida prostática, que es un marcador característico de los carcinomas prostáticos.

FUNDAMENTO

La fosfatasa ácida (ACP) hidroliza el α-naftil fosfato a pH 5,2 con liberación de fosfato y α-naftol. El naftol reacciona a su vez con un diazorreactivo presente en el sistema (Fast Red TR) produciendo un pigmento amarillo, de modo que el aumento de la absorbancia, leído a 405 nm, es proporcional a la actividad de fosfatasa ácida total (ACP) de la muestra. Cuando se mide la actividad en presencia de tartrato, se inhibe la actividad de la isoenzima prostática.

FOSFATASA ÁCIDA

Las fosfatasas alcalinas forman una gran familia de enzimas glicoproteicas. Esta es una familia muy antigua desde el punto de vista filogenético y está ampliamente distribuida en la naturaleza. Se encuentran en muchos organismos desde las bacterias hasta el hombre, incluyendo procariotas y eucariotas, con la excepción de algunas plantas superiores. Su localización celular sugiere su participación en el movimiento de moléculas través de la membrana celular. A nivel óseo se expresa en la membrana del osteoblasto cuando éstos se diferencian a partir de las células progenitoras. En el hígado se la encuentra en la membrana luminal de las células epiteliales de los canalículos biliares, en el riñón, en la membrana apical de los túbulos contorneados proximales y en menor medida en los distales, en el intestino, en la membrana apical de los enterocitos, y en la placenta, en el sincitiotrofoblastos. En los seres humanos es una enzima ubicua, localizada en diversos tejidos fisiológicos algo opacos. Cataliza la hidrólisis de una gran variedad de monoésteres fosfóricos a pH alcalino. La actividad total de la ALP está representada por las diferentes formas de presentación de la enzima en: isoenzimas (formas múltiples), isoformas y macroenzimas

FUNDAMENTO

La separación electroforética sobre acetato de celulosa o agarosa, fundamentada en la separación por la carga eléctrica de las proteínas-enzimas enfrentadas a un campo eléctrico, permite una inspección global de todas las formas presentes en el suero y ofrece la posibilidad de detectar las formas atípicas. Para la visualización y cuantificación de las formas se utiliza una reacción específica con un sustrato, un éster monofosfórico como el alfa-naftil fosfato de sodio o el fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, y un colorante que indique color en la zona de la reacción enzimática entre la isoenzima, isoforma o macroenzima presente y el sustrato, como los colorantes: fast-violet, fast-red o nitroazul de tetrazolio.

ATPasa a ph 4.5 y 9.4

Las ATPasas son una clase de enzimas que catalizan la descomposición de ATP en ADP y un ion de fosfato libre. Esta reacción es energética ya que libera energía, que se utiliza en la mayoría de los casos para llevar a cabo otra reacción química acoplada. Se conoce como desfosforilación al proceso que efectúa una ATPasa sobre una molécula de ATP, este proceso libera energía, que la enzima aprovecha para impulsar otras reacciones químicas que, de otro modo, no se podrían producir. Algunas de esas proteínas son proteínas integrales de membrana (ancladas a la membrana plasmática) y los solutos se mueven a través de la membrana contra su gradiente de concentración. Estas reciben el nombre de ATPasas transmembrana.

FUNDAMENTO

La unión de ATPasa a la enzima en condiciones de equilibrio se mide mediante técnica radiactiva y filtración de las muestras. El procedimiento permite distinguir entre unión específica y no específica de [y-32P]ATP utilizando doble marcaje radiactivo. Para ello se utiliza un segundo marcador radiactivo con espectro energético claramente distinto del de "P. Se suele realizar a a 25 °C incubando 0'4 mg/ml de vesículas de RS en un medio compuesto por: Mops 20 mM, pH 7'0, MgCl, 1 mM y EGTA 1 mM. La molécula ATPasa con la adenina en conformación anti y los tres grupos fosfatos extendidos de demuestran en amarillo-marrón.

Deshidrogenasa succínica

La succinato deshidrogenasa o succinato coenzima Q reductasa es una flavoproteína ligada a la membrana interna mitocondrial que interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de electrones y que contiene FAD (flavín-adenín-dinucleótido) unido covalentemente. La molécula de FAD del enzima, es el aceptor de electrones de la reacción. En general la función bioquímica del FAD es oxidar los alcanos a alquenos, mientras que el NAD+ oxida los alcoholes a aldehídos o cetonas. Esto es debido a que la oxidación de un alcano (como el succinato) a un alqueno (como el fumarato) es suficiente exergónica como para reducir el FAD a FADH2, pero no para reducir el NAD+ a NADH. Es poco usual hallar una unión covalente entre el FAD y una proteína, en la mayoría de los casos, el FAD se encuentra unido a su enzima asociado de forma no covalente (unión débil y transitoria).

FUNDAMENTO

La demostración de esta enzima se realiza mediante una reacción colorimétrica, para ello se utiliza Ácido succínico al 3%, Azul de metileno al 0.1%, muestra, Fenol al 90% y Aceite mineral. Fenol: Desnaturalizar a la proteína. Azul de metileno: detección cuantitativa del estado de oxidación-reducción. Es un aceptor electrónico artificial coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se re oxida la coenzima FAD Aceite Mineral: Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire se re oxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una capa de aceite mineral. Se produce una decoloración de azul a tono rosado debido a la reducción del azul de metileno que fueron cedidos desde el FADH2 obteniendo FAD oxidado y azul de metileno reducido. Además el azul de metileno al aceptar los electrones nos da una reacción verdosa.

NADH

La NADH participa, entre muchas reacciones, alguna de ellas es la oxidorreducciones ligadas a procesos de producción energética, como la fermentación de la glucosa y la degradación aeróbica de ácidos grasos, azúcares y aminoácidos. Primero se produce NADH que posteriormente es regenerado a NAD+ no hay producción energética directa, por lo tanto se produce a partir de estas coenzimas. En las degradaciones aeróbicas, el NADH producido por las deshidrogenasas del ciclo de Krebs o de la β-oxidación son oxidadas por la cadena respiratoria y en último término sus electrones van a parar al oxígeno, teniendo lugar al mismo tiempo la fosforilación oxidativa, con producción de ATP.

FUNDAMENTO

Para la demostración de la enzima NADH el método más usado se fundamenta fluorescencia ya que la enzima es excitada con luz ultravioleta. El NADH tiene varias funciones esenciales en el metabolismo. Actúa como coenzima en las reacciones redox: donante de grupos ADP-ribosa en las reacciones de ADP-ribosilación, precursor del segundo mensajero de la molécula cíclica de ADP-ribosa y como sustrato para las ADN ligasas bacterianas. El NADH absorbe fuertemente en el ultravioleta debido a la base adenina que posee y en solución tiene un pico de emisión a 460 nm y una vida útil de fluorescencia de 0,4 ns. La forma oxidada de la coenzima (NAD+) no fluoresce. Las propiedades de la señal de fluorescencia cambian cuando el NADH se une a las proteínas, por lo que estos cambios pueden ser utilizados para medir constantes de disociación, que son útiles en el estudio de la cinética enzimática.

Fosforilasa

Esta enzima tiene una gran importancia metabólica, cataliza la reacción de degradación del glucógeno, hepático o muscular. La reacción de degradación es una fosforólisis realizada sobre un residuo α-1,4-glucosil situado en los extremos no reductores de α-glucanos como amilopectina, amilosa o glucógeno. Utiliza como cofactor piridoxal fosfato. La enzima hepática controla el nivel de glucemia sistémica. Por ello es una enzima fuertemente regulada alostéricamente, mediante una activación ejercida por AMP e inhibición por ATP, ADP y glucosa-6-fosfato.

FUNDAMENTO

El método para la detección de fosforilasa por fluorescencia se basa en la incorporación de un indicador fluorescente de glucosa al glucógeno. Se puede realizar en homogeneizados de tejidos o en células vivas obtenidas a partir de órganos o de cultivos celulares. Consiste en varias etapas: Preparación de la muestra Marcaje fluorescente del glucógeno Registro de la fluorescencia. Cuanto mayor es la intensidad de la fluorescencia, más elevado es el contenido de fosforilasa.

Citocromo c oxidasa

La citocromo c oxidasa es el miembro terminal de la cadena respiratoria en todos los animales y plantas, levaduras aerobias y algunas bacterias. Esta enzima siempre se encuentra asociada a una membrana: la membrana mitocondrial interna en organismos superiores o la membrana celular en bacterias. Se trata de una enzima multisubunidad grande, compleja, cuya caracterización se ha visto complicada por su tamaño, por el hecho de estar unida a la membrana y por la diversidad de los cuatro sitios metálicos redox.

FUNDAMENTO

La tinción de citocromo C oxidasa diferencia entre el tipo de fibras, identifica las fibras con acumulación mitocondrial anormal y con carencia de actividad enzimática. Esta técnica es más específica de las miopatías mitocondriales debido a que las fibras anormales producen una reacción débil e irregular o no la presentan. La técnica de tincion de la enzima citocromo C oxidasa (COX-SDH) permite identificar en color azul las fibras anormales que carecen de la actividad de la citocromo C oxidasa, pero conservan la actividad de la succinato deshidrogenasa, mientras que las fibras normales se observan de color café debido a la oxidación del reactivo de diaminobencidina por la citocromo C oxidasa.

ATPasa

Las ATPasas son una clase de enzimas que catalizan la descomposición de ATP en ADP y un ion de fosfato libre. Esta reacción es energética ya que libera energía, que se utiliza en la mayoría de los casos para llevar a cabo otra reacción química acoplada. Se conoce como desfosforilación al proceso que efectúa una ATPasa sobre una molécula de ATP, este proceso libera energía, que la enzima aprovecha para impulsar otras reacciones químicas que, de otro modo, no se podrían producir. Algunas de esas proteínas son proteínas integrales de membrana (ancladas a la membrana plasmática) y los solutos se mueven a través de la membrana contra su gradiente de concentración. Estas reciben el nombre de ATPasas transmembrana.