Chimica Filograna

estrazione del DNA!

Esperimento realizzato da noi

DNA fingerprinting

DNA della Banana

riusciremo ad estrarlo?

L'esperimento si è svolto nel laboratorio della sede A. Meucci in via Pendino. La classe 5^As, insieme alla professoressa Buccarella, si è cimentata in questo divertente ed utile esperimento.

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introduzione

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1. introduzione

Il materiale genetico, sottoforma di Dna, è contenuto in tutte le cellule viventi e abbonda nel nucleo delle cellule eucariote. Il Dna contenuto in una cellula però, non essendo visibile ad occhio nudo (ma solo al microscopio) deve essere visualizzato facendo aggregare molte molecole di DNA, che formeranno una massa visibile e filamentosa, come le catene nucleotidiche che la copongono.

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obiettivo

Estrarre il DNA da alcuni frutti (in questo caso una banana) in quantità sufficiente da poterlo visualizzare.

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Materiale utilizzato

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materiale

• Banana (un terzo per gruppo)

storia della banana

• Sale (3 grammi)

• 10 ml di detersivo liquido per piatti

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• 5 ml di succo di limone

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• 6 ml di alcool denaturato

• 1 becher e 1 bicchiere di plastica

• 10 ml di detersivo liquido per piatti

• una provetta da 50 ml e una da 15 ml

• un panno isostatico

• una forchetta

• un cucchiaio

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Ad oggi la banana è uno dei frutti più comuni e più coltivati al mondo, non c'è adulto o bambino che non la conosca. Ma da dove deriva e come è arrivata in tutto il mondo? La pianta di banana è molto antica e deriva dal sud-est asiatico. Le prime tracce di questo frutto sono state trovate in Papua Nuova Guinea, datate all'incirca 9.000 anni fa e solo successivamente la pianta è stata coltivata in Cina, Malesia e Filippine, arrivando fino in Africa. Il primo casco di banane arrivò in Sud America non prima del 1500 grazie ai coloni portoghesi, tornando poi verso l'Europa al rientro dal Nuovo Continente appena scoperto. Già queste poche informazioni ci fanno capire una cosa importante: la banana non è americana come immaginiamo! Abbiamo semplicemente associato questo frutto al Sud America perché molte delle attuali compagnie che lo esportano in tutto il mondo lo coltivano proprio lì.

STORIA DELLA BANANA

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Da un punto di vista tassonomico, il banano (cioè la pianta che sviluppa le bacche di banana) è un ibrido sterile tra due specie, la Musa acuminata e la Musa balbisiana, due piante originarie del sud-est asiatico. La classificazione dei cosiddetti cultivar (= varietà) è ancora in fase di dibattito. Anticamente il frutto (o meglio, la bacca) di questa pianta produceva semi piuttosto grossi non molto graditi, ecco perché si cominciò a selezionare e incrociare varietà selvatiche diverse creando frutti più grandi, corposi e con semi sempre più piccoli. Le abbiamo letteralmente addomesticate, ma le abbiamo rese sterili e prive di semi.

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Ma quindi come si generano le banane? Per "partenocarpia", il che vuol dire che queste piante non hanno bisogno di semi per sviluppare un nuovo frutto.Sostanzialmente, quindi, tutte le banane che compriamo nei nostri supermercati sono cloni, bacche geneticamente identiche all'originale. Applichiamo quindi a nostro vantaggio un metodo già comune in natura.In linea di massima questo significa che, se provenienti dalla stessa piantagione, abbiamo elevate probabilità che una banana che troviamo a Milano sia geneticamente identica a una banana comprata a Berlino, e che quella che mangerai domani è "la stessa" che hai mangiato l'altro ieri. Assurdo. Cioè, mangiamo sempre lo stesso organismo in un certo senso, da decine e decine di anni!Nelle distese agricole si generano nuove piante a partire da una porzione di pianta madre, senza che ci sia riproduzione sessuata e quindi ricombinazione genica. Insomma, il DNA è sempre lo stesso.

STORIA DELLA BANANA

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Oltre ad essere cloni, le banane di oggi non sono le stesse del passato…Erano estremamente dolci, con un retrogusto e una consistenza totalmente diversa da quelle di oggi. E no, non è questione di ricordi ormai svaniti né di nostalgia dell'infanzia, è davvero così: le banane di oggi sono diverse da quelle che mangiavano i nostri genitori, nonni e bisnonni.Fino agli anni '50, infatti, la varietà Gros Michel è stata la banana più comune. Il suo nome ufficiale è Musa acuminata Colla (Gruppo AAA), cultivar Gros Michel, ma possiamo chiamarla amichevolmente Big Mike. Questo cultivar è stato attaccato da un fungo parassita che ha infettato gran parte dei raccolti: questa infezione conosciuta come "malattia di Panama" ha praticamente sterminato questa varietà, che è stata rimpiazzata da quella attuale chiamata Cavendish, più resistente al patogeno.Ad oggi è praticamente impossibile non incappare nelle Cavendish: sono quelle che troviamo nel banco frutta dei supermercati di tutto il mondo, belle carnose e dal tipico colore giallo intenso.

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In realtà esistono altre varietà di banane (chiamate in genere platani) ma non tutte sono commestibili né molto richieste dal mercato mondiale.In parte le banane sono a rischio di estinzione. Come già avvenuto in passato con la varietà Gros Michel, anche le Cavendish potrebbero essere spazzate via da malattie di varia natura. La questione è piuttosto semplice ma non per questo di poco conto: in mancanza di diversità genica (determinata dalla riproduzione sessuata che di fatto non avviene) la varietà può diventare estremamente vulnerabile e sensibile. Se intaccata da qualche agente patogeno può scomparire in un baleno!

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Una storia simile è avvenuta in Irlanda verso la metà dell'800 con le patate, che diede la giusta spinta verso la fine della schiavitù in America.Un possibile e futuro flagello per le banane Cavendish potrebbe essere il fungo Fusarium oxysporum (Foc TR4). Si tratta di un organismo in grado di attaccare l'apparato vascolare di molte specie vegetali e causarne l'avvizzimento irreversibile. Colpita una singola pianta, l'intera piantagione è a rischio e in molti casi l'unica via è abbandonarla. Non è uno scherzo, ci sono di mezzo protocolli strategici, enti e organizzazioni mondiali tra cui l'European Food and Safety Authority visto che questo fungo è in grado di attaccare varietà e specie diverse. Infatti, delle 400 varietà di banana a rischio ce n'è anche una tipica del Madagascar a cui appartengono pochissimi esemplari, che potrebbero "salvare" da questo sterminio le banane che conosciamo oggi.

STORIA DELLA BANANA

procedura

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PROCEDURA

• Tagliare in 3 parti la banana e prenderne un terzo

• Metterlo nel becher e ridurlo in poltiglia con la forchetta

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Il tessuto vegetale dev'essere ridotto in poltiglia per favorire la rottura della parete, della membrana cellulare e del tessuto in modo da renderli più facilmente aggredibili dalle sostanze chimiche con cui entrerà in contatto.

PROCEDURA

• Aggiungere un cucchiaio raso di sale fino e un cucchiaio di detersivo per piatti. Dopodichè mescolare delicatamente per non creare bollicine.

• Aggiungere circa 50 ml di acqua e continuare a mescolare delicatamente.

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Il sale provoca la fuoriuscita dell'acqua delle cellule per osmosi e, di conseguena, il loro raggrinzimento. Inoltre provoca la disidratazione del DNA che tende a concentrarsi in una massa compatta.

PROCEDURA

• Filtrare la miscela ottenuta in un bicchiere di plastica utilizzando un panno isostatico

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La poltiglia viene filtrata attraverso il panno isostatico per separare la soluzione contenente di DNA e i residui cellulari dai frammenti grossolani di tessuto.

PROCEDURA

• Recuperare 5 ml di filtrato e aggiungere un uguale volume di succo di limone in una provetta. Dopodichè miscelare capovolgendo in modo lento la provetta senza mai agitare

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Il detersivo per i piatti scioglie i fosfolipidi della membrana plasmatica e della membrana nucleare, permettendo la fuoriuscita del DNA.

PROCEDURA

• Prelevare 3 ml della soluzione filtrata e, dopo averla versata nella provetta da 15 ml, aggiungere due volumi di alcool denaturato facendolo scendere lungo le pareti della provetta che verrà tenuta inclinata.

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PROCEDURA

• Infine lasciare riposare la provetta finchè non cessano le bollicine: sarà così possibile visualizzare il DNA salire verso l'alcool

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risultato

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risultato

All'interfaccia tra la soluzione acquosa e l'alcol compare una massa filamentosa bianca, costituita principalmente dal DNA. La massa tende ad aumentare con lo scorrere dei minuti, poichè si aggregano sempre più molecole di DNA.

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al microscopio!

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DNA fingerprinting

come si fa?

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introduzione

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2. introduzione

Il fingerprinting del DNA (o impronta digitale del DNA) è una tecnica che permette l’identificazione individuale a livello molecolare, analizzando le caratteristiche uniche del DNA di un individuo.L’applicazione del fingerprinting del DNA sta rivoluzionando la medicina forense, i test di paternità, l’identificazione di vittime di disastri.

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obiettivo

Estrarre il DNA (in questo caso dalle cellule della bocca)

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Materiale utilizzato

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materiale

• bastoncino idrofilo

• termostato

• centrifuga

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• cloruro di sodio al 5%

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• etanolo al 70%

• una provetta da 1,5 ml

• etanolo assoluto

procedura

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PROCEDURA

• Passare un bastoncino idrofilo sulle gengive e all'interno delle guance.

• Inserire il bastoncino in una provetta da 1,5 ml che contiene 500 microlitri di una soluzione

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La soluzione serve a rompere le cellule e liberare il DNA.

PROCEDURA

• Mettere la provetta a 50° in un termostato per 5 minuti

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L'incubazione attiva un enzima, la proteinasi K, che distrugge le proteine consentendo una preparazione di DNA pulita.

PROCEDURA

• Al termine dei 5 minuti la provetta viene centrifugata per 10 minuti

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In questo modo si depositeranno i detriti cellulari e rimarrà il DNA in soluzione.

PROCEDURA

• In seguito si noteranno 2 strati, lo strato inferiore è il pellet, mentre quello superiore è il surnatante; Prelevare 400 microlitri di surnatante, e aggiungere 20 microlitri di cloruro di sodio al 5% e 400 microlitri di etanolo assoluto

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Il cloruro di sodio al 5% neutralizza le cariche negative del DNA. Il DNA non è solubile in alcol e questo passaggio serve a farlo precipitare in modo da recuperarlo facilmente

PROCEDURA

• Mescolare bene capovolgendo la provetta e centrifugare ancora per 5 minuti; Questa volta non servirà il surnatante ma il pellet che contiene il DNA precipitato, quindi facendo attenzione a non perderlo eliminare il liquido e risospendere il pellet in 200 microlitri di etanolo al 70%

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L'etanolo al 70% serve per lavare il pellet di DNA per eliminare eventuali impurità.

PROCEDURA

• La provetta torna in centrifuga per altri 5 minuti; eliminare ancora il surnatante; E' necessario far asciugare bene il pellet, quindi lasciare la provetta aperta nel termostato a 60° per almeno 10 minuti

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Bisogna far evaporare l'alcool perchè il DNA dovrà essere risospeso in una soluzione acquosa, se rimane alcool il DNA non si scioglierà.

PROCEDURA

• Quando il pellet è completamente secco viene risospeso in 50 microlitri di tampone (soluzione che contiene rnasi, cioè enzimi che degradano l'RNA e rendono il DNA recuperato più puro);

• Mettere il campione a 37° per 10 minuti in modo che gli enzimi abbiano il tempo di agire.

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conclusioni

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conclusioni

Il DNA appena estratto è DNA genomico, cioè l'intera sequenza del materiale genetico delle cellule contenute nella bocca. Ma per avere la propria impronta genetica si necessita dei microsatelliti, delle sequenze speciali e variabili che compongono lo 0,5% del nostro DNA.

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DIFFERENZA TRA PROCEDURE

differenze tra procedure

• Per distruggere la membrana cellulare, nel video si utilizza una soluzione contenente l'enzima proteinasi K che distrugge gli istoni legati al DNA come l'acido citrico contenuto nel succo di limone dell'esperimento fatto in laboratorio (nelle cellule umane non è presente la membrana cellulare poihcè si tratta di cellule animali e non vegetali).
• La filtrazione col panno isostatico non viene effettuata, al suo posto viene inserita la centrifugazione che permette di far depositare sul fondo i residui del tessuto e di conservare nel servatante la soluzione che contiene iL DNA. A questo punto viene aggiunto NaCl per floccolare le cariche negative del DNA e anzichè versare alcol denaturato si centrifuga nuovamente la soluzione con etanolo asooluto. In questo modo il DNA precipiterà e si troverà nel pellet. Per separare il DNA dagli altri acidi nucleici si aggiunge una soluzione che contiene RNAsi per distruggere l'RNA. Così si osserverà il DNA dell'individuo.