Tinción GRAM

PRESENTAción

La tincion gram

Entendemos como tinción GRAM un metodo de laboratorio que consiste en clasificiar como reaccionan las bacterias al tinte, diferenciando las GRAM+ y las GRAM-

ÍNDICE

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Medio de cultivo

Prueba con la mano "limpia"

Prueba con la mano "sucia"

Reproduccion de la muestra

Tincion GRAM

Observaciones

Medio de cultivo

01

Lo primero que deberemos hacer es un medio para que vivan nuestras bacterias, y para ello haremos el siguiente proceso.

¿Como se hace un medio de cultivo?

Presentar la disolución en la placa

Liquido principal

Adimentos a la disolución

Tras una esterlizacion de la disolcion, vertimeros el liquido en una placa petrea. Tras su enfriamiento y su gelificación, tendremos el medio echo.

Tras tener la disolucion de caldo echa, procederemos a añadirle adimentos para hacer el medio lo mas efectivo posible.

El liquido sin ningun adimento estaria absado en un concentrado de caldo.

+ INFO

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Muestra con la mano "limpia"

02

Tras la gelificacion del medio, marcaremos los dedos en esta, usando el recurso del mechero antes mencionado para minimizar la posibilidad de contaminación. Usaremos mascarilla, o evitaremos respirar encima, y estara abierta el minimo tiempo posible. Esperaremos un minimo de 24 h para ver los resultados.

Muestra con la mano "limpia"

En nuestra muestra podemos ver las siguientes cosas:Residuos de las disoluciones, cosa que potencialmente puede ser provocada por no haber removido lo suficiente el liquido. Tambien podemos ver una potencialmente colonia bacteriana, seguramente al no haberse lavado las manos del todo bien, o a la hora de haber echo el procedimiento de tocar la placa, haya habido algun tipo de contaminación.

Muestra con la mano "Sucia"

03

El mismo día en el cual hicimos la otra prueba, haremos esta, pero ahora sin lavarnos las manos. Haremos el mismo procedimiento, es decir, cerca del mechero, con mascarilla o sin respirar, y muy rapidamente.Esperaremos minimo 24h para poder ver resultados.

Resto de aditivos

Hongo

Colonia bacteriana

Muestra con la mano "Sucia"

En nuestra muestra tuvimos algun problema. Lo primero que podemos notar es que esta vuelve a tener "grumos", o restos de los aditivos que pusimos a la hroa de crear el medio, cosa que corrovora nuestra hipotesis de su porque. (Al estar en ambas, limpias o no las manos) Tambien podemos ver un gran número de colonias, algunas mas grandes, otras menos, algunas con capsula (se ven como más mocosas), etc. Pero tambien podemos ver un hongo, producto de un mal proceso preventivo de contaminación. Aun asi, este hongo no es lo suficientemente grande como para estropear toda la muestra, todas las colonias, habiendo algunas que se han quedado totalmente libres de sus antibioticos. (Podemos ver una especie de halo alrededor del hongo, que corresponderia al antibiotico)

Reproducción de la muestra

04

Tras comprobar que hay alguna colonia que nos pueda ser util, es decir, que no este contaminada, procederemos reproducir la muestra en otra placa. Para ello, haremos el siguiente procedimiento.

reproducir muestra

Esparcimos la muestra en la placa en forma de "árbol"

Esterilizamos asa de siembra

Volvemos esterilizar el asa de siembra, para no contaminar muestras futuras.

Extraemos una muestra de las colonias utiles

más de 24h

Muestra reproducida, eso quiere decir que:-Deberia ser la misma bacteria (Si esta echo correctamente) -No tiene contaminantes que perjudiquen a la tinción.

Tinción Gram

05

Tras tener la muestra util para la tincion, es decir, una vez reproducida, y sin ningun tipo de contaminacion, procedemos a tintarla, para asi, poder verla y clasificarla.

paso 3

Paso 2

paso 4

paso 1

Observaciones

06

Ahora que tenemos la muestra perfecta para poder verla, vamos a ver, que vemos.

Observaciones

Ahora es el momento donde tras todo este largo proceso tendremos que analizar lo que vemos, que tipo de bacteria es, como hemos echo las tinciones, etc. Podemos decir que esta muestra son de unas bacterias GRAM- ya que a la hora de lavar por primera vez con el alcohol, como no fijo del todo bien el colorante (debido a una pared celular mas fina), se quedó mas el segundo, la fucsina, por ello, vemos este color rosado. En general podemos decir que la muestra ha salido. No esta perfecta, pero tampoco esta mal. Al final y al cabo se ven las células, cosa que una practica de laboratorio escolar no es del todo normal, y principalmente en este tipo de pruebas es lo que se busca.

Liquido principal

El primer paso es en un litro de agua, donde previamente habremos comprobado que su ph sea neutro, echaremos una pastilla de caldo concentrado, o en su defecto, 10g a granel. Tras su previa disolucion, verteremos 250ml del contenido en una botella de vidrio Pirex, o un matraz Erlenmeyer; (siendo estos recipientes de 500ml). Estos deberan de estar previstos de algun tipo de tapon, ya sea de algodón (En caso de que usaramos el matraz), o en su defecto un tapon entreabierto (si es el caso que usamos la botella de vidrio Pirex).

Adimentos a la disolución

Lo primero que añadiremos es agar-agar. Este es un gelificante, es decir, va a solidificar la muestra. Echaremos 5g de agar-agar comercial. Tambien añadiremos 2g de glucosa (en forma de azucar de mesa) para asi añadir una fuente de carbono. Y por ultimo añadiremos 0,2g de cloruro de sodio (sal común). Pero como nosotros estamos haciendo una practica escolar, y tenemos falta de material para medir una cantidad tan precisa, acabamos redondeando en: "una pequeña pizca".

Presentar la disolución en la placa

Por ello, para evitar este tipo de problemas, haremos este proceso justo debajo de un mechero, con mucho cuidado de no respirar encima, e incluso si es posible, el uso de mascarillas quirurjicas.Hacemos esto al lado de un mechero para evitar que esporas que haya en el ambiente, en el lugar que estamos haciendo el proceso caigan en la muestra, ya que el fuego del mechero crea una corriente de aire ascendiente que evita que caiga. Aun asi trataremos de que este el minimo tiempo abierto para minimizar al maximo las posibilidades de contaminación.Consideraremos que la muestra esta conmaniada en el momento en el que haya un hongo, ya que este, al expandirse, creara antibiotico, matando asi las colonias bacterianas.

Lo primero que tenemos que hacer antes de echar el liquido, es asegurarnos de que esta esteríl, es decir, no queda ninguna contaminante residual. Para ello lo pasteurizamos, siendo esto un proceso que consiste en calentar mucho la muestra durante un corto tiempo, en nuestro caso, un minuto tras su ebullición. Una vez echo este proceso, verteremos el liquido en una placa petrea de 90mm. Verteremos 25ml de esta disolución y tras un minimo de 24h para que se enfrie y se solidifique, tendremos nuestro medio de cultivo. En el proceso en el cual vertemos la disulocion en la placa, buscamos que no haya ninguna bacteria residual, ni espora que pueda ser contaminante

Paso 1, la muestra

Cogeremos un portaobjetos previamente esterilizado, y usaremos el asa de siembre previamente esterilizada en el fuego para coger una pequeña muestra, y tras un par de gotas de agua destilada en el porta objetos, esparciremos la muestra, buscando que no quede ningun pegote, ni ningun trozo de medio en mitad del portaobjetos. Tras ello, volveremos a esterilizar el asa de siembre para evitar llevar celulas de esta muestra a otra muestra si usamos el mismo asa de siembra.

Paso 2, Cristal violeta y lugol

El siguiente paso seria teñir la muestra con cristal violeta, por lo que tras echarla bien por toda la muestra, esperaremos un minuto, y la aclaremos con agua destilada. Tras eso para fijar bien el colorante lo que haremos sera echar lugol, que tambien tendra un tiempo de accion de 1 min. cuando acabe el minuto lo aclaramos con alchol, y despues con agua destilada.

Paso 3, fucsina y mechero

Tras el paso anterior, debemos echar la fucsina sobre la muestra, dejando que haga acción durante un minuto. Tras ello lo lavaremos con agua corriente, y secaremos muy suavemente el exceso de liquido con un papel, o en su defecto, con un mechero, le iremos dando poco a poco calor, para que asi se evapore el exceso de liquido (no puede haber nada de liquido) Tras eso, si no hemos quemado la muestra, estara casi lista para ser observada

Paso 4, ver al microoscopio

Tras haber quitado todo el liquido sobrante, nos dirijimos a la sala donde estan los microoscopios, y echamos con mucho cuidado una o dos pequeñas gotas de aceite de inmersion sobre la muestra, para evitar una vibracion por el calor del microoscopio.Tras echar el aceite, ponemos encima un cubreobjetos quitando en una direccion el aire para evitar la nombrada vibración, y lo vemos en el microoscopio.

Partes sin la fucsina

Podemos ver partes donde el color rosado de la fucsina falta, cosa que podria explicarse por no haber disuelto o no haber esparcido del todo bien el colorante en la muestra.

Grumo de cristal violeta

Podemos ver grumos de cristal violeta, ya que vemos connotaciones de un pigmento el cual no pertenece a las células. Seguramente esto pasó por no enjuaguar del todo bien la muestra por miedo a enjuagarla demasiado para asi no llevarse de por medio tambien las bacterias, es decir la muestra.

Forma de la bacteria

Podemos decir que las bacterias tienen una forma redonda, por lo que son del tipo coco, las cuales corresponden directamente con este grupo.