AMGEN 23 24

AMGEN S1 Découverte du matériel et des gestes techniques

Il s’agit de vous faire découvrir le matériel couramment utilisé en Biotechnologies et de leur faire acquérir la maîtrise des gestes techniques que vous aurez à mettre en œuvre lors des 3 sessions suivantes de génie génétique. Le travail de cette première session se décompose en 2 « manips » : Manip 1.1 Pipetages de précision (Micro volume) , dépôts sur feuille, dépôts en gel d’agarose. Manip 1.2 Dépôt en gel d’agarose, mise en œuvre d’une électrophorèse.

START

Objectifs de la Manip1.1 1.2 -Session 1

• Manip 1.1 Pipetages de précision (Micro volume) , dépôts sur feuille, dépôts en gel d’agarose. Manip 1.2 Dépôt en gel d’agarose, mise en œuvre d’une électrophorèse.

Rappel : Projet AMGEN

• Session 2 : Clonage du gène rfp dans plasmide pARA=> pARA-R

• Session 3 Transformation bactérienne Ecoli avec pARA-R
• Session 4 : PCR sur colonie pour vérifier présence pARA_R

Déroulé Session 1 Manip1.1 & 1.2 -Micro volume et electrophorese

Réflexion Préliminaire

Réalisations Pratiques

Exploitation des résultats

Comprendre le prinicpeet les étapes d'une electrophorese

Observons/ Réflechissons

M1. Utiliser une micro pipette M2- Rélaliser une electrophorese

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Manipulations= session 1.2

Principe electrophorese sur gel agarose

L'électrophorèse est — avec la chromatographie — la principale des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules. la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique. Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette , Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molécules cationiques (+) se déplacent vers la cathode (−).

les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

Manipulations= session 1.2

EXPLOITATION DES RÉSULTATS

MANIP 1.1. Manipulation des micropipettes Après avoir utilisé́ ce matériel, pouvez-vous expliquer point par point comment mesurer précisément un volume de 20 μL d’une solution à l’aide d’une micropipette. MANIP 1.2. Electrophorèse en gel d’agarose (séparation de trois colorants). A partir de l’observation du gel : Q1. Déterminer le nombre de colorants différents présent dans chaque échantillon Q2. Déduire la charge ionique portée par chaque colorant (positive ou négative). Q3. Si on considère que ces trois colorants sont des molécules de formes semblables, est-il possible de les classer de la plus petite à la plus grande ? ».

Manipulations= Déterminer le nombre de colorants différents présent dans chaque échantillon Q2. Déduire la charge ionique portée par chaque colorant (positive ou négative). Migration vers l'anode (Pole +) donc Molécules chargé - Q3. Si on considère que ces trois colorants sont des molécules de formes semblables, est-il possible de les classer de la plus petite à la plus grande ? » Classement selon la taille des molcéule Colorant 1 Colorant 2 Colorant 3

EXPLOITATION DES RÉSULTATS

ATELIER « CLONAGE DE PAPIER » Il s’agit de reproduire la réaction de clonage avec des modèles en papier, des ciseaux et du ruban adhésif. Les plasmides sont représentés, sur la feuille annexe, sous forme de bandes rectangulaires. Procéder de la manière suivante : Préparation des modèles papier 1. A l’aide de ciseaux, découper soigneusement le contour des rectangles correspondant aux plasmides pKAN-R et pARA. 2. A l’aide du ruban adhésif transparent, coller les rectangles «ori» l’un sur l’autre. Attention, la face écrite de chaque bande doit être exposée à l’extérieur. Digestion enzymatique 3. A l’aide de ciseaux, découper selon les pointillés, les sites BamHI et HindIII. Ligation 4. Faire correspondre les extrémités complémentaires des sites de restriction et les coller à l’aide du ruban adhésif transparent. Il est ainsi possible de former deux nouveaux plasmides 5. Montrer le plasmide nouvellement formé qui porte le gène rfp. Le représenter sous forme d’un schéma sur la feuille de résultats.

Session 2 Manip3 : Construction plasmide recombinant pARA-R

Rôles Ori: ............................................. Amp R: ...................................... pBAD ...................................... Ara C : séquence de contrôle d’expression génique. Permet l’activation de la transcription du gène rfp quand on ajoute de l’arabinose, un sucre, dans le milieu de culture de la bactérie. rfp: ......................................

MANIP 1.1. Manipulation des micropipettes petite à la plus grande ? ».

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Session 3 Manip5 : Transformation bactérienne

Transformation génétique de la bactérie E. coli par le plasmide pARA-R et mise en culture des bactéries transformées

MANIP 1.1. Manipulation des micropipettes petite à la plus grande ? ».

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Objectifs de la Manip5 -Session 3

• Dans cette 3ème session, il s’agit de transformer génétiquement des bactéries E. coli à l’aide du plasmide pARA-R et de cultiver ces bactéries.
• L’utilisation de milieux de culture adéquats permet de vérifier rapidement que, d’une part les bactéries ont bien été transformées par le plasmide et, d’autre part, qu’elles produisent bien la protéine RFP.

Rappel : Projet AMGEN

• Session 2 : Clonage du gène rfp dans plasmide pARA=> pARA-R

• Session 3 Transformation bactérienne Ecoli avec pARA-R
• Session 4 : PCR sur colonie pour vérifier présence pARA_R

Déroulé Session 3 Manip5 -Transformation E;coli par PARA-R

Réalisations Pratiques

Exploitation des résultats

Observons/ Réflechissons

M1. MANIP 5 : INTRODUCTION DU PLASMIDE RECOMBINANT DANS DES BACTÉRIES

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Manipulations Sesson 3= Réaliser un logigramme pour la purification / Lister le materiel nécessaire

Matériel Avant de commencer à manipuler, vérifiez que vous avez : 3 boîtes de Petri contenant : 1 gélose LB (trait noir) 1 gélose LB/amp (trait noir / trait bleu) 1 gélose LB/amp/ara (trait noir / trait bleu / trait rouge) 2 microtubes de 1,5 mL vides 1 marqueur 1 micropipette P20 et 1 boîte de cônes jaunes 1 micropipette P200 2 paquets d’étaleurs à bactéries stériles Gants/lunettes/poubelle de paillasse/bécher de javel

Déroulé Session 3 Manip5 -Transformation E;coli par PARA-R

Réalisations Pratiques

Exploitation des résultats

Observons/ Réflechissons

M1. MANIP 5 : INTRODUCTION DU PLASMIDE RECOMBINANT DANS DES BACTÉRIES

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Exploitation MANIP 5 (SESSION 3)

Q1. Concernant les bactéries P-, interpréter la différence observée entre la gélose LB et la gélose LB + Ampicilline. Q.2 Concernant les bactéries P+, interpréter la différence observée entre la gélose LB, la gélose LB + Ampicilline et la gélose LB + Ampicilline + Arabinose. Q3. Désigner, en le justifiant, une colonie pour réaliser une culture en milieu liquide de bactérie productrice de la protéine RFP. Quels constituants doit contenir le milieu de cette culture ? ».

Manipulations SESSION 3 MANIIP 5 TRANSFORMATION Q1. Concernant les bactéries P-, interpréter la différence observée entre la gélose LB et la gélose LB + Ampicilline. BACTÉRIES P- : Culture sur LB & absence de culture sur LB+Amp E;COLI Non transformées qui ne possedent pas de plasmide redcombiannt doncc pas de gène de resistance ampR Cultivent sur LB mais pas sur LB amp Valide que le milieu LB amp ne selectionnent que bactéries recombinante Q.2 Concernant les bactéries P+, interpréter la différence observée entre la gélose LB, la gélose LB + Ampicilline et la gélose LB + Ampicilline + Arabinose. BACTÉRIES P+ : Culture sur LB Amp & LB E;COLI transformées qui possedent de plasmide redcombiant apporte le gène de résistance à l'ampiciline Valide que le milieu LB amp ne selectionnent que bactéries recombinante Q3. Désigner, en le justifiant, une colonie pour réaliser une culture en milieu liquide de bactérie productrice de la protéine RFP. Quels constituants doit contenir le milieu de cette culture ? LB + ampiciline + arabinose pour activer le promoteur pARA et induire l'expression de la RFP

Déroulé Session 4 Manip7 -Purification RFP

Réflexion Préliminaire

Réalisations Pratiques

Exploitation des résultats

Comprendre le prinicpe et les étapes de la Chromatographie

Observons/ Réflechissons

M1. Lyse cellulaire (Page 5/6)M2Purification de la RFP par Chromatographie

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Manipulations= Réaliser un logigramme pour la purification / Lister le materiel nécessaire

Déroulé Session 4 Manip6 -PCR de contrôle et purification RFP

Réflexion Préliminaire

Réalisations Pratiques

Exploitation des résultats

Comprendre le prinicpe et les étapes de la Chromatographie

Observons/ Réflechissons

Manip 6 : La PCR sur colonie pour vérifier la présence du plasmide pARA-R dans les bactéries rouges. Manip 7 : La chromatographie sur colonne pour extraire et purifier la protéine rouge fluorescente produite par les bactéries transformées.

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RÉFLEXION PRÉLIMINAIRE

1) Ennoncer le principe de la PCR et répondre aux quiz Vidéo: https://youtu.be/QBcxFwp3Byo 2) Argumenter l'utilisation de la PCR pour contrôler les colonies recombinante 3) Expliquer les deux types de bactéries recombinantes qu'il est possible de cultiver sur LB Amp »

Manipulations= Réaliser un logigramme pour la PCR de verification (Contrôle)

Exploitation MANIP 6 (SESSION 4)

Déroulé Session 4 Manip7 -purification RFP

Réflexion Préliminaire

Réalisations Pratiques

Exploitation des résultats

Comprendre le prinicpe et les étapes de la Chromatographie

Observons/ Réflechissons

Manip 6 : La PCR sur colonie pour vérifier la présence du plasmide pARA-R dans les bactéries rouges. Manip 7 : La chromatographie sur colonne pour extraire et purifier la protéine rouge fluorescente produite par les bactéries transformées.

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La chromatographie est une méthode de séparation qui permet isoler un composant, purifier unproduit brut de synthèse ou pour analyser un mélange. Les méthodes chromatographiques sont classées selon la nature des interactions physico-chimiques. La chromatographie sur colonne est une chromatographie d’adsorption : la séparation est fondée sur un processus d’adsorption / désorption des molécules sur la phase stationnaire.

Manipulations= Réaliser un logigramme pour la purification / Lister le materiel nécessaire

Exploitation des résultats