Ideonella sakaiensis metodologías

Ideonella sakaiensis

Biodegradación de PET y sus posibles aplicaciones

Metabolismo central

Morfología

Obtención de la información

Historia y ubicación geográfica

Obtención de colonias bacterianas para un futuro aislamiento

Respiración

Taxonomía

Taxonomía

La botella se corta en cuadros pequeños para revisar la presencia de Ideonella.

Toma de muestra de botella de PET del centro de reciclaje en Osaka, Japón.

Muestreo

Colocar el plástico con bacterias en un medio de cultivo YSV durante 24-48 horas para extraer la bacteria del PET

Cultivar en medio YSV con película de PET durante 1 semana

Inoculación en medios con fuente de carbono

Inocular una colonia e incubar otras 24 horas

Lavar y transferir película de PET a nuevo medio

Incubar 24 horas

Revisar presencia de bacteria mediante microscoía electrónica

Aislamiento

Inoculación en medios suprimidos de fuente de carbono

Incubación a 30 °C con agitación por 20 días

Inocular biopelícula en agar NBRC 982

Incubar 1 semana

Incubar con agitación a 30-37 °C

Medios líquidos

pH 7-7.5

Cultivo

Inocular bacteria pura

Medios sólidos

Realizar el aislamiento de la bacteria en un tubo de liofilización

Colocar un lioprotector para salvaguardar la muestra

Liofilizar a una temperatura de entre -40°C a -50°C

PCR

Conservación

NOTA

Agar NBRC 802 y 928

Pruebas fenotípicas

Tinción de Gram

Identificación

Catalasa

Pruebas bioquímicas

Oxidasa

Rojo Fenol

Voges Proskauer

FIN

Referencias

Macroscópica: En agar NBRC 802 y 928 Tamaño: 0.5-1 mm Forma: Circulares elevadas y con borde definido Color: Traslucidas a tonalidad crema Microscópica: Bacilo gram negativo, no esporulado y móvil gracias a un flagelo polar, posee un tamaño de 0.6-0.8 μm de ancho por 1.2-1.5 μm de largo

No existe una clave bioquímica bien diseñada para identificar Ideonella sakaiensis. La identificación fenotípica se puede realizar basándose en las características bioquímicas mencionadas anteriormente y en la observación microscópica junto con el informe de microscopía electrónica que sugiere la presencia de un solo flagelo.

Historia y Ubicación

La Ideonella Sakaiensis es una bacteria que fue descubierta en Osaka, Japón, en el año 2016, en un centro de reciclaje de PET. Debido a su dependencia de usar el PET como fuente primaria de carbono, no se ha podido encontrar aún en un hábitat natural de ningún área circundante de Japón.

Historia y Ubicación

La Ideonella sakaiensises una bacteria que fue descubierta en Osaka, Japón, en el año 2016, en un centro de reciclaje de PET. Debido a su dependencia de usar el PET como fuente primaria de carbono, no se ha encontrado aún en la naturaleza.

Se encarga de procesar azúcares y convertirlas en compuestos que luego son redirigidos al resto del metabolismo y, en última instancia, a todas las funciones celulares.

• Descarboxilación del piruvato a acetil CoA I
• Ciclo de Krebs (TCA)
• Glucólisis
• Vías de las pentosas fosfato
• Cadena transportadora de electrones

La identificación molecular mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el único método preciso disponible para identificar Ideonella sakaiensis

1)

2)

3)

4)

Llenar la cámara de electroforesis con 300 ml de Tampón de electroforesis.

Preparación del molde y gel de agarosa

Sembrar 20 microlitros de muestra

Añadir la solución de agarosa al molde.

5)

6)

Observar

Llevar a cabo la electroforesis

Cultivo puro

2)

3)

1)

Transferir 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo

Preparar cultivo puro

Añada 5 gotas del indicador de Rojo de metilo

Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa

4)

NEGATIVO

POSITIVO

Observar

Vías metaólica: Glucólisis

Cultivo puro

2)

3)

1)

Transferir 1 mL del cultivo en un tubo de ensayo

Preparar cultivo puro

Añada 12 gotas de α- naftol al 5% en etanol

Determinar la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro. el acetilmetilcarbinol (acetoina), a partir de la fermentación de la glucosa (fermentación butilen-glicólica).

Vías metaólica: Glucólisis

5)

4)

Añada 4 gotas de KOH al 40%, agite y deje reposar por 5 a 10 min

NEGATIVO

POSITIVO

Observar

2)

3)

1)

Colocar un trozo de papel de filtro

Depositar sobre el reactivo masa bacteriana

Añadir una gota del reactivo de oxidasa.

Prueba rápida y sencilla que permite la detección de la enzima citocromo-c-oxidasa presente en los géneros Comamonadaceae.

4)

Vías metaólica: Cadena transportadora de electrones

Observar

2)

3)

4)

1)

Aplicar cristal de violeta en el portaobjetos por 60 segundos. Lavar el portaobjetos con agua.

Aplicar safranina durante 45 segundos. Lavar con agua.

Aplicar yodo sobre el portaobjetos durante 60 segundos. Lavar con agua.

Aplicar alcohol etílico 95% de 5 a 10 segundos. Lavar con agua.

5)

La identificación se basa en diferencias de la estructura de la pared celular y en la forma en que reacciona frente a diversos reactivos que se utilizan durante la tinción.

Observar en el microscopio.

Referencias:

1. Dahal P. A Guide to Ideonella sakaiensis (Plastic-Eating Bacteria) [Internet]. Microbe Notes. Sagar Aryal; 2023 [cited 2023 Aug 31]. Available from: https://microbenotes.com/ideonella-sakaiensis-plastic-eating-bacteria/
2. Academic-accelerator.com. [cited 2023 Aug 31]. Available from: https://academic-accelerator.com/encyclopedia/ideonella-sakaiensis
3. Hiraga K, Taniguchi I, Yoshida S, Kimura Y, Oda K. Biodegradation of waste PET: A sustainable solution for dealing with plastic pollution. EMBO Rep [Internet]. 2019;20(11). Available from: http://dx.doi.org/10.15252/embr.201949365
4. 10.22607. [cited 2023 Aug 31]. Available from: http://10.22607/IJACS.2021.904032
5. Biocyc.org. [cited 2023 Aug 31]. Available from: https://biocyc.org/GCF_001293525/new-image?object=Energy-Metabolism
6. Biocyc.org. [cited 2023 Aug 31]. Available from: https://biocyc.org/GCF_001293525/NEW-IMAGE?type=PATHWAY&object=TCA
7. Biocyc.org. [cited 2023 Aug 31]. Available from: https://biocyc.org/GCF_001293525/NEW-IMAGE?type=PATHWAY&object=NONOXIPENT-PWY
8. Biocyc.org. [cited 2023 Aug 31]. Available from: https://biocyc.org/GCF_001293525/NEW-IMAGE?type=PATHWAY&object=ANAGLYCOLYSIS-PWY
9. Biocyc.org. [cited 2023 Aug 31]. Available from: https://biocyc.org/GCF_001293525/NEW-IMAGE?type=ECOCYC-CLASS&object=Electron-Transfer
10. Biocyc.org. [cited 2023 Aug 31]. Available from: https://biocyc.org/GCF_001293525/NEW-IMAGE?type=PATHWAY&object=PYRUVDEHYD-PWY
11. Podstawka A. Ideonella sakaiensis 201-F6.
12. Ver Todas las Entradas de MAR. Ideonella sakaiensis [Internet]. Microbiologia para humanos. 2020 [citado el 31 de agosto de 2023]. Disponible en: https://microbiologiaparahumanos.wordpress.com/2020/10/07/ideonella-sakaiensis/
13. Ideonella sakaiensis [Internet]. NaturaLista Mexico. [citado el 31 de agosto de 2023]. Disponible en: https://www.naturalista.mx/taxa/1203731-Ideonella-sakaiensis
14. Taxonomy browser (Ideonella sakaiensis) [Internet]. Nih.gov. [citado el 31 de agosto de 2023]. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=1547922
15. Catalogue Detail [Internet]. Nite.go.jp. [citado el 31 de agosto de 2023]. Disponible en: https://www.nite.go.jp/nbrc/catalogue/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=110686
16. Yoshida S, Hiraga K, Taniguchi I, Oda K. Ideonella sakaiensis, PETase, and MHETase: From identification of microbial PET degradation to enzyme characterization. En: Weber G, Bornscheuer UT, Wei R, editores. Methods in Enzymology. San Diego, CA, Estados Unidos de América: Elsevier; 2021. p. 187–205.
17. 羊正鈺. 生命會找到出路？日本科學家發現「愛吃PET塑膠」的細菌 [Internet]. The News Lens 關鍵評論網. 2016 [citado el 2 de noviembre de 2023]. Disponible en: https://www.thenewslens.com/article/38532/fullpage
18. Ideonella sakaiensis [Internet]. Luweibio.com. [citado el 2 de noviembre de 2023]. Disponible en: https://www.luweibio.com/junzhong/3417.html

1)

2)

3)

Se siembra en toda la superficie sobre una plac a con medio de cultivo base sólido.

Se toma una muestra del cultivo líquido.

incubar a 37°C/24-48 h

4)

Agar NBRC 802 y 928Tamaño: 0.5-1 mm Forma: Circulares elevadas y con borde definido Color: Traslucidas a tonalidad crema

Observar

• Enzimas PETasa y MHETasa
• Economía circular
• Posibles aplicaciones

2)

3)

1)

NEGATIVO

POSITIVO

Colocar una gota de agua oxigenada

Observar si hay o no formación de burbujas

Suspender bacteria

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

Vías metaólica: Cadena transportadora de electrones

Macfaddin, Jean F. Pruebas Bioquímicas Para La Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3rd ed., Madrid., Médica Panamericana, Cop, 2003. “Pruebas Bioquímicas - Labster.” Theory.labster.com, theory.labster.com/es/biochemical-identification-bacteria/. Accessed 29 Oct. 2023.