MODERN ZEN PRESENTATION

TALLER 7. Microorganismos del suelo y digestión anaeróbica de residuos agrícolas

15. Evaluación de la producción de biogás

14. Procedimiento biogas

13. TRATAMIENTOS

12. INTRODUCCION 2

6. FIJACION DEL NITROGENO MOLECULAR

11. OBJETIVO PARTE 2

5. CICLO NITROGENO

10. PARTE 2

4. INTRODUCCION 1

9. Sulfato-reduccion, sulfo-oxidacion, solubilizacion de fosfatos

3. OBJETIVO PARTE 1

8. AMONIFICACION, CELULOLISIS Y AMIOLISIS

2. INDICE

7. DESNITRIFICACION

1. TITULO

INDice

OBJETIVO PARTE 1: MICROORGANISMOS DEL SUELO Reconocer los grupos fisiológicos de microorganismos del suelo mediante: su cultivo en medios selectivos que provean nutrientes adecuadas para su desarrollo y las condiciones ambientales requeridas.

INTRODUCCIÓN Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayoría de los procesos naturales que afectan al ambiente. Un ejemplo es la fijación del nitrógeno molecular por los organismos de vida libre y los simbióticos Los restos de animales y microbianos sufren una serie de procesos de degradación que asegura la continuidad de los ciclos biogeoquímicos

Celulolisis, amilolisis

Fijación de nitrógeno molecular

Sulfo-oxidación

Sulfato-reducción

DESNITRIFICACION

nitrificacion

Amonificación

Ciclo del Nitrogeno

PROCEDIMIENTO

DETECCION

Fijación de nitrógeno molecular

PROCEDIMIENTO

DETECCION

DESNITRIFICACION

Amilolisis

Celulolisis

PROCEDIMIENTO

DETECCION

PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTO

DETECCION

DETECCION

Amonificacion

PROCEDIMIENTO

DETECCION

PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTO

DETECCION

DETECCION

Solubilización de fosfatos

Sulfo-oxidación

Sulfato-reducción

PARTE 2: LA DIGESTIÓN ANAERÓBICA COMO TRATAMIENTO DE RESIDUOS SÓLIDOS

OBJETIVO PARTE 2: La digestión anaeróbica como tratamiento de residuos sólidos. Conocer un mecanismo de transformación de residuos agrícolas sólidos en biogas y un lodo fertilizante, através de la digestión anaeróbica.

Tratamiento de residuos sólidos Actualmente se producen enormes cantidades de residuos sólidos que requieren una eliminación segura. Parte de este material inerte, está compuesto de vidrio,metales, plásticos, etc., pero el resto son residuos orgánicos sólidos descomponibles, como desperdicios de cocina, papel, y otra basura. Otrasgrandes fuentes de residuos son: fango de aguas residuales, derivados del tratamiento de residuos líquidos, y residuos de origen animal procedentes de la ganadería intensiva, de explotaciones avícolas y porcinas a gran escala. En las granjas tradicionales a pequeña escala, la mayor parte de los residuossólidos orgánicos se transformaba en abono y vuelven a los campos como estiércol. En sociedades caracterizadas por la urbanización y la agricultura intensiva, la eliminación de residuos orgánicos es un problema difícil y caro.

INTRODUCCIÓN

Digestión anaeróbica: Las denominadas bacterias metanógenas implicadas en la digestión son anaerobias estrictas y reducen al dióxido de carbono.Pertenecen a los géneros Methanococcus spp, Methanobacterium spp, Methanosarcina spp y otros. El gas formado en la fermentación metánica es una mezcla de metano y dióxido de carbono. Dependiendo de la composición del material de partida, se puede producir biogás con alrededor de 7% demetano. Se emplea estiércol, paja y lodo procedente de otro digestor.

Compostaje: ofrece una alternativa atractiva a diferencia de los vertederos. Tiene ventajas ambientales considerables. Se requiere una separación inicial de los residuos sólidos en sus porciones orgánica e inorgánica. La fabricación decompost es un proceso microbiano que convierte los residuos orgánicos putrescibles en un producto estable e higiénico, parecido al humus, y puede utilizarse para la mejora del suelo

Vertederos: los residuos sólidos, orgánicos e inorgánicos, se depositan en terrenos hundidos. Dentro del vertedero los microorganismos anaerobios y los facultativos atacan a los componentes orgánicos de los residuos. La desventaja es que sufre una descomposición lenta durante unperiodo de 30 a 50 años. En este periodo, el vertedero se hunde lentamente y se produce metano.

Las opciones disponibles para resolver el problema actual de los residuos orgánicos, se basan en la eliminación del mismo por medio de la actividad microbiana. Los tratamientos que pueden ser utilizados son:

PROCEDIMIENTO

Para comprobar la producción de biogás

• se coloca en una damajuana de 10 L, unos 2 kg de estiércol

fresco de vaca, 1/4 kg de paja cortada en trozos pequeños y agua hasta unos 10 cm de la boca.

• Poner un tapón atravesado por un agitador y un tubo para la salida de los gases.
• Instalar el fermentador en un baño de agua a 37ºC.
• Unir la salida a un frasco lavador y éste a otro frasco abierto para equilibrar la presión, y a una llave de triple vía que está conectada al depósito de gas (cámara de automóvil) y al mechero.

• Entre el mechero y la llave de triple vía se coloca un tubo de vidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama.

• Controlar la hermeticidad de todos los cierres.
• Agitar diariamente la mezcla en descomposición.
• Luego de uno o dos días vaciar la cámara para eliminar la mezcla explosiva de biogás y aire.
• Dejar llenar nuevamente el depósito
• comprobar cómo arde el biogás.
• Controlar diariamente el nivel de agua del baño, la temperatura y la cantidad de gas.

Evaluación de la producción de biogás

gracias!

El medio de cultivo contiene: fosfato dipotásico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Se reparte en tubos a razón de 5mL en cada uno y ese esteriliza 20 minutos a 110ºC. Se agrega a cada tubo 1 mL de una solución a 10% de monosulfuro de sodio y se siembra unos gránulos de suelo. Se incuba a 25-27ºC durante dos a tres semanas.

El medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2g, glucosa 20g, agar15g, agua1 L,fosfato tricálcico 2 g. Se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri. Se siembra unos gránulos y se incuba a 25-27ºC porsiete días.

Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitrito se comprueba agregando 1 mL delreactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

• Disolver 0,05g de naftilamina en 100mL de ácidoacético al 30% (v/v) en agua.
• Disolver 0,32g de ácidosulfanilico en 100mL de ácido acético al 30%(v/v) en agua

El almidón y la celulosa están compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de diferente manera . La celulosa es insoluble y formalargas fibrillas a las que se encuentran los microorganismos que la degradan se digieren a menor velocidad. Muchos hongos son celulolíticos, pero entre las bacterias unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos. El almidón, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias Las bacterias celulolíticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece.Por otra parte, ese proceso fundamental que ocurre durante el compostaje de residuos agrícolas, donde predominan los microorganismos termófilos.

Celulolisis, amilolisis

Tanto la formación de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioautótrofos constituyen procesos metabólicos aeróbicos generadores de energíael nitrito es asimilado mas facil por las plantas y como es soluble en agua resulta ser lavado por los suelos, en cambio el amonio queda fuertemente adsorbidos en la arcilla

Nitrificacion

El nitrógeno tiene tres formas estables de oxidación en la naturaleza (nitrógeno molecular, amoníaco, nitrato) cuya interconversión está dada casi exclusivamente por bacterias La oxidación del amonio a nitrato se denomina nitrificación

• Las bacterias autótrofas aerobias las llevan a cabo en dos etapas:
• 1) oxidación del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus
• 2) oxidación del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus

Desnitrificación

• PROCESOS DE RESPIRACION ANAEROBIA
• PUEDEN SER UTILIZADAS COMO RECEPTOR FINAL DE ELECTRONES

ENTEROBACTERIASreducen anaerobicamente nitrato en NH4-BACTERIAS DESNITRIFICANTES se da por oxidacion de NO3 hasta N2

• OXIDOS DE NITROGENO FORMADOS
• NO
• N2O
• N2

ESCAPAN DEL SUELO

El medio contiene: manitol 10 g, carbonatode calcio0,5 g,solución salina 50mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razón de 50mL en cada uno y se esteriliza a 110ºC durante 20minutos. La solución salina contiene: fosfato dipotásico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g, cloruro de sodio2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua1 L ,pH7 -7,5. La solución de oligoelementos contiene 0,05 g/L de las sales siguientes: molibdato de potasio, borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato de manganeso, cloruroférrico.Medio para Azotobacter: saCarosa 20 g, fosfato dipotásico 0,05 g, fosfato monopotásico 0,15 g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g,molibdato de sodio 0,002 g, cloruroférrico 0,01g, azul de bromotimol (al0,5%p/venetanol) 2mL, carbonato de calcio 1g, agua 1 L, pH6,8; esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Medio para Derxia: Reemplazar la sacarosa por almidón o glucosa y omitir el carbonatode calcio. Medio para Azospirillum: ácido málico 5 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g, sulfato de manganeso 0,01g, etilén-diamino-tetra-acetato férrico (al 1,64% p/v) 4 mL, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 3mL, biotina 0,1mg, agua 1 L, pH6,8.Medio para Clostridium pasteurianum: glucosa 10 g, fosfato monopotásico 0,75 g, solución salina 50mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita de Durham. Luego de sembrar cubrir conagar al 1,5% fundido o vaselina.

Ver si el clavo se ha ennegrecido por la formación de sulfuro de hierro debido a los microorganismos.

Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitrito se comprueba agregando 1 mL delreactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

• Disolver 0,05g de naftilamina en 100mL de ácidoacético al 30% (v/v) en agua.
• Disolver 0,32g de ácidosulfanilico en 100mL de ácido acético al 30%(v/v) en agua

El sulfuro de hidrógeno (=ácido sulfhídrico), el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables importantes del azufre. Elsulfuro de hidrógeno estóxico para lamayoría de los organismosylossulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del género Thiobacillus y azufre elemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuáticos, el que seacumula en la célula, sufriendo una posterior oxidación en algunos casos. La mayoría de los microorganismos oxidantes del azufre son autótrofos obligados.

Sulfo-oxidación

Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitrito se comprueba agregando 1 mL delreactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

• Disolver 0,05g de naftilamina en 100mL de ácidoacético al 30% (v/v) en agua.
• Disolver 0,32g de ácidosulfanilico en 100mL de ácido acético al 30%(v/v) en agua

El sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de hidrógeno por bacterias heterotróficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidente en los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o ácidos orgánicos como fuente de carbono, pero algunas especies crecen autotróficamente con hidrógeno molecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio.

Sulfato-reducción

Algunos géneros de bacterias con especies fijadoras de nitrógeno de vida libre

Hacia el tercer día de incubación el medio se enturbia ligeramente y en la superficie aparece un velogrisáceo. Los días siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del líquido. A su vez el líquido se enturbia cada vez más y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observación microscópica del velo muestra células bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esféricos, mientras que el material tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Grampositivo o variable.

Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitrito se comprueba agregando 1 mL delreactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

• Disolver 0,05g de naftilamina en 100mL de ácidoacético al 30% (v/v) en agua.
• Disolver 0,32g de ácidosulfanilico en 100mL de ácido acético al 30%(v/v) en agua

El medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1mL, agua 1L. Se distribuye en tubos y se esteriliza a110ºC durante 20 minutos.Se siembra unos gránulos de suelo y se incuba por siete días 25-27ºC.

El medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solución salina 50mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensión de suelo, que haya sido abonado con estiércol, e incubardos a tres semanas a 25-27C. Medio para clostridios: sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotásico 0,7 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g, carboximetilcelulosa1 g, extracto de levadura 1 g, azul demetileno (0,005% p/v) 1 mL, agar 15 g, agua1L, pH7,0; esterilizara121ºC durante 15 minutos. Agregar 0,5mL de clorhidrato de cisteína (al 1% p/v) a cada tubo con 10 mL de medio estéril fundido, sembrar de inmediato con unas gotas de la suspensión de suelo y colocar en agua fría para una rápida gelificación.

El medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1g, fosfato dipotásico 0,5g, sulfato de magnesio heptahidrato 2g, sulfato de sodio 0,5g, cloruro de calcio 0,1g, lactato de sodio (al60%p/v) 6 mL, extracto de levadura1g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Se reparte en tubos colocando 10mL en cada uno. Se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos. Se siembra unos gránulos de suelo y se introduce un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Se cubre con agar al 1,5% fundido o vaselina. Se incuba por 14 días a 25-27ºC.

Volcar 2mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de ácido clorhídrico concentrado y añadir 5 gotas de solución acuosa de cloruro de bario al 5%. p/v. La aparición de una opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana.

Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitrito se comprueba agregando 1 mL delreactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

• Disolver 0,05g de naftilamina en 100mL de ácidoacético al 30% (v/v) en agua.
• Disolver 0,32g de ácidosulfanilico en 100mL de ácido acético al 30%(v/v) en agua

Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitrito se comprueba agregando 1 mL delreactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

• Disolver 0,05g de naftilamina en 100mL de ácidoacético al 30% (v/v) en agua.
• Disolver 0,32g de ácidosulfanilico en 100mL de ácido acético al 30%(v/v) en agua

El medio de cultivo contiene: almidón soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solución salina 50mL, solución de oligoelementos 1mL, agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Distribuir en cajas de Petri. Se siembra unos gránulos de suelo por siete días e incubara25-27ºC.

La demostración de la amonificación se basa en investigar amoníaco mediante el reactivo de Nessler en el medio acuoso con aminoácidos (peptona, etc). La solución de yodo-mercuriato potásico alcalinizada origina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo según la cantidad de amoniaco presente

Amonificacion

El nitrógeno orgánico de los productos de hidrólisis de proteínas y polinucleótidos,se convierte en amoníaco por el proceso de desaminación. La urea se hidroliza rápidamente a amoníaco y dióxido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos

Hacia el tercer día de incubación el medio se enturbia ligeramente y en la superficie aparece un velogrisáceo. Los días siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del líquido. A su vez el líquido se enturbia cada vez más y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observación microscópica del velo muestra células bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esféricos, mientras que el material tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Grampositivo o variable.

Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitrito se comprueba agregando 1 mL delreactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

• Disolver 0,05g de naftilamina en 100mL de ácidoacético al 30% (v/v) en agua.
• Disolver 0,32g de ácidosulfanilico en 100mL de ácido acético al 30%(v/v) en agua

Cubrirla superficie con solución acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de hidrólisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul.

Observar la formación de una zona transparente al rededor de las colonias

El medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio5 g, glucosa 10 g, solución salina 50mL, solución de oligo elementos1mL, agua1L. Se esterilizan a 110ºC durante 20 minutos.Se inocula gránulos de suelo en tubos que llevan dentro una campanita de vidrio sin agitar y se incuba por siete días 25-27ºC. NitrificaciónEl medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5g, carbonato de calcio1 g, solución salina 50mL, agua 1L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250mL de capacidad, a razón de 50 mL en cada uno.El medio para productores de nitratos contiene: 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de amonio. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Se Siembra unos gránulos de suelo en ambos matraces y se incuba a 25-27ºC durante 14días.

Después agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparición de un color ladrillo indica la presencia de amoniaco. El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes igual es en el momento de usar.

• Colocar en un mortero 5g de ioduro mercúrico y 3,65g de ioduro de potasio, añadir un poco de agua

destilada y triturar hasta disolver. Completara 100mL con agua.

• Disolver 15g de hidroxido de potasio en lentejas en 100mL de agua destilada.

Fijación de nitrógeno molecular

El nitrógeno es reducido a amonio en el proceso de fijación catalizado por el complejo nitrogenasa, La enzima es inactivada por el oxígeno. El nitrógeno molecular es muy inerte y su reducción requiere muchaenergía. Azotobacter crece en un medio líquido sin agitaciónl. Es bastante sensible a la acidez, no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio se observan bacilos gramnegativos, acompañados de células de mayor tamaño con paredes gruesas conocidas como cistos. Esta bacteria tiene una gran capacidad respiratoria o, pues la fijación requiere mucha energía.

Donde el papel sobresale del líquido se acumulan las bacterias celulolíticas aerobias y suelen colorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de las fibras bajo la lupa. Comprobar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa.