TRANSCRIPTÓMICA - RETROTRANSCRIPCIÓN

Retrotranscripción

Alcalá Alonso María Campos Rodríguez Esthefanya Navarro Ramírez Brenda Lizeth Velazquez Vargas Ana Nayeli Juan Pablo González Hornelas

Dra. Abril Saint Martin Castellanos Laboratorio de Genómica y proteómica 24 de octubre de 2023

Índice

03. ¿Cuál es el objetivo de adicionar oligo d(T) para realizar la retrotranscripción?

04. ¿Qué es el cDNA?

01. Esquemas del proceso de retrotranscripción.

• Tubo A

05. Técnica de PCR en tiempo real (usando SyberGreen) para determinar el nivel de expresión de un transcrito.

• Tubo B

• Tubo A + B

6. ¿Qué ventajas posee la qPCR (PCR en tiempo real) sobre la PCR punto final?

02. ¿Por qué se requiere que el RNA se retrotranscriba para determinar la presencia del RNAm?

07. Referencias

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Esquemas del proceso de retrotranscripción

En un tubo A adiciona RNA total + oligo de T + dNTPs e incuba a 65°C. ¿Qué sucede en este escenario?

Se extrajo 3 μl de RNA de la muestra con cáncer de colon, a eso se le añaden 8 μl de agua, 1 μl mix de dNTPs, y 1 μl de oligo T. Lo que ocurrirá en este escenario es el reconocimiento exclusivo del mRNA, esto gracias al acoplamiento del oligo T en la cola de poli A en el extremo 3' del mRNA.

Figura 1. Esquema tubo A

En un tubo B adiciona RTPolimerasa + Buffer 5X + Inhibidor de RNasas. ¿Qué sucede en este escenario?

Se colocaron 4 μl de buffer 5x, 1 μl de enzima retro transcriptasa y 1 μl de inhibidores de RNAsas. Aún no ocurre una reacción en este escenario, solo se preparan más reactivos para iniciar la reacción de la cadena de la polimerasa.

Figura 2. Esquema tubo B

Adiciona el tubo B al tubo A e incuba a 55°C. ¿Qué sucede en este escenario?

Al añadir el tubo B al tubo A, la retrotranscriptasa va a reconocer al oligo T unido al mRNA en el extremo 3', y empezará a sintetizar una cadena cDNA complementaria en dirección 5’ a 3’ a partir del mRNA, esto porque el RNA es inestable y la taq polimerasa utilizada en la PCR no reconoce uracilos, debido a esto se hace una retrotranscripción. El buffer brinda cofactores que estabilizan la reacción y las inhibidoras de las RNAsas evitan que el RNA se degrade mientras ocurre la reacción.

Figura 3. Esquema tubo A + tubo B

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¿Por qué se requiere que el RNA se retrotranscriba para determinar la presencia del RNAm?

¿Por qué se requiere que el RNA se retrotranscriba para determinar la presencia del RNAm?

El ARN mensajero (ARNm) es una molécula de ARN, y las técnicas comunes de detección y cuantificación, como la PCR, están diseñadas para trabajar con ADN, además el ARN es muy inestable para trabajar con el y la taq polimerasa usada en la PCR no reconoce uracilos, por lo que no podría llevar a cabo la reacción. Para poder utilizar estas técnicas, es necesario convertir el ARNm en una forma de ADN, conocida como ADN complementario (cADN). La retrotranscripción es el proceso que permite esta conversión. Además, el cADN es más estable que el ARN, lo que facilita su almacenamiento y manipulación en experimentos posteriores.

• Molecularmente, la retrotranscripción es catalizada por una enzima llamada transcriptasa reversa. Esta enzima toma una molécula de ARN y utiliza sus nucleótidos como molde para sintetizar una hebra complementaria de ADN. La dirección de la síntesis es 5' a 3', similar a la replicación del ADN. Al final del proceso, el resultado es una molécula de cADN de doble hebra que refleja fielmente la secuencia del ARN original.

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¿Cuál es el objetivo de adicionar oligo d(T) para realizar la retrotranscripción?

¿Cuál es el objetivo de adicionar oligo d(T) para realizar la retrotranscripción?

El oligo d(T) es un cebador que se hibrida con la cola poli-A presente en el extremo 3' del ARN mensajero eucariótico. Su adición garantiza que la retrotranscripción se dirija específicamente hacia los mRNAs, evitando otros tipos de ARN. Además, favorece la síntesis de cDNA de longitud completa, representando toda la longitud del mRNA.

• A nivel molecular, el oligo d(T) es una secuencia corta de nucleótidos de timidina. Cuando se añade a una solución que contiene ARN mensajero (que tiene una cola poli-A al final de su estructura), el oligo d(T) se hibrida o se une complementariamente a esta cola poli-A. Esta unión proporciona un punto de inicio o "cebado" para la transcriptasa reversa para comenzar la síntesis de cADN.

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¿Qué es el cDNA?

¿Qué es el cDNA?

El cADN, o ADN complementario, es una forma de ADN que se genera a partir de un molde de ARN mediante el proceso de retrotranscripción. Es una réplica de una molécula de ARN pero en forma de ADN. Es útil en biología molecular porque es más estable que el ARN y puede ser amplificado y detectado mediante técnicas como la PCR.

• Molecularmente, el cADN es una réplica de doble cadena del ARN original. Es generado por la acción de la transcriptasa reversa, que primero sintetiza una hebra de ADN complementaria al ARN, y luego, utilizando esta hebra recién formada como molde, sintetiza la hebra complementaria. El resultado es una molécula de ADN de doble cadena que es un reflejo del ARN del que se originó.

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Técnica de PCR en tiempo real (usando SyberGreen) para determinar el nivel de expresión de un transcrito.

Técnica de PCR en tiempo real (usando SyberGreen) para determinar el nivel de expresión de un transcrito.

SyberGreen es un tinte fluorescente que se une a ADN de doble hebra. A nivel molecular, cuando el SyberGreen se encuentra libre en solución (no unido al ADN), emite muy poca fluorescencia. Sin embargo, al unirse al ADN, su estructura molecular cambia de una forma que emite fluorescencia cuando se excita con luz de una longitud de onda específica. Durante cada ciclo de la PCR, a medida que se forman más productos de doble hebra, más moléculas de SyberGreen se unen y, por lo tanto, hay un aumento en la fluorescencia detectada. Las máquinas de PCR en tiempo real tienen sensores que detectan esta fluorescencia, lo que permite la cuantificación.

La PCR en tiempo real, también conocida como qPCR, es una técnica que permite cuantificar el número de copias de un segmento específico de ADN en tiempo real durante la PCR. Cuando se usa SyberGreen, un tinte fluorescente que se une al ADN de doble hebra, la cantidad de fluorescencia producida es proporcional a la cantidad de producto de PCR (amplicón). Durante cada ciclo de la PCR, a medida que se producen más copias del segmento de ADN objetivo, aumenta la fluorescencia. Comparando la fluorescencia de una muestra desconocida con estándares conocidos, se puede determinar la cantidad inicial de ADN objetivo en la muestra. En el contexto de la expresión génica, la qPCR permite cuantificar el nivel de un transcrito particular en una muestra, reflejando la actividad del gen correspondiente.

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¿Qué ventajas posee la qPCR (PCR en tiempo real) sobre la PCR punto final?

¿Qué ventajas posee la qPCR (PCR en tiempo real) sobre la PCR punto final?

Sensibilidad y Rango Dinámico: La qPCR puede detectar y cuantificar cantidades muy pequeñas de ADN y tiene un rango dinámico más amplio.

• Rapidez: Los resultados se obtienen en tiempo real y no requieren pasos posteriores, como la electroforesis en gel, para visualizar los productos.
• Especificidad: La qPCR permite la detección específica de productos amplificados mediante el uso de sondas específicas o tintes como SyberGreen.
• Menor Riesgo de Contaminación: Al no requerir manipulación post-PCR (como abrir tubos para electroforesis), hay menos riesgo de contaminación y menos manipulación del ADN amplificado.
• Cuantificación Absoluta o Relativa: La qPCR puede utilizarse para determinar la cantidad exacta (absoluta) de ADN objetivo o para hacer comparaciones relativas entre muestras.
• Automatización y Multiplexación: Permite la automatización y el análisis simultáneo de múltiples muestras y objetivos.

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Referencias

Referencias

• Ecogen. (s/f). 5x MyTaq™ Reaction Buffer Colorless. Recuperado de: https://www.ecogen.com/es/p1/5x-mytaq-reaction-buffer-colorless
• Rodríguez, G. (2014). Retrotranscripción de RNA. Recuperado de: https://www.iib.uam.es/portal/documents/76122/76162/RETROTRANSCRIPCION+DE+ARN+V2.pdf/4e93a2a0-de61-40c1-9d93-d20d73b5df30
• Universidad Complutense de Madrid. (s/f). Diseño experimental y análisis de datos en la técnica qRT-PCR (quantitive Real Time-Polymerasa Chain Reaction). Recuperado de: https://www.ucm.es/data/cont/docs/261-2019-03-22-pr%C3%A1ctica%204_DISE%C3%91O%20EXPERIMENTAL%20Y%20AN%C3%81LISIS%20DE%20DATOS%20EN%20LA%20T%C3%89CNICA%20DE%20LA%20RT%20qPCR%20(1).pdf
• National Human Genome Research Institute. (2023). ADNc (copia). Recuperado de: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/ADN-copia
• Espinoza, E. (2011). PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de Norovirus. Tesis para optar al título de Máster en Microbiología Médica, Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (UNAN-León), Facultad de Ciencias Médicas, Nicaragua. Recuperado de: http://riul.unanleon.edu.ni:8080/jspui/bitstream/123456789/348/1/220101.pdf
• Thermo Fisher Scientific. (s/f). ¿Sabe qué es la PCR? Recuperado de: https://www.fishersci.es/es/es/scientific-products/publications/lab-reporter/2021/issue-1/should-you-use-digital-or-real-time-PCR.html