PRESENTACIÓN SALUD

P3S2. rETROTRANSCRIPCIÓN.

Luis Mauricio Peña Cacique 00483417Valeria Franco Zárate 00481327Regina Ramírez Lara 00457957Ana Valentina Castro Dorantes 00492838

ÍNDICE

1. Esquema del proceso de retrotranscripción

2. ¿Por qué se requiere que el RNA se retrotranscriba para determinar la presencia del RNAm?

3. ¿Cuál es el objetivo de adicionar oligo d (T) para realizar la retrotranscripción?

4. ¿Qué es el cDNA?

5. Técnica de PCR en tiempo real para determinar un transcrito

6. ¿Qué ventajas posee la qPCR (PCR en tiempo real) sobre la PCR punto final?

7. Referencias

1. PROCESO DE RETROTRANSCRIPCIÓN EN ESQUEMAS

PROCESO DE RETROTRANSCRIPCIÓN EN ESQUEMAS

(vueltos timina)

2. ¿Por qué se requiere que el RNA se retrotranscriba para determinar la presencia del RNAm?

La retrotranscripción de RNA a DNA es necesaria para determinar la presencia del RNAm debido a que el DNA es más estable y más fácil de detectar que el RNA. Sabemos que el RNA tiene uracilo y el DNA timina, entonces, la DNA polimerasa que utilizamos no está diseñada para leer uracilo, es por eso que tenemos que hacer la retrotranscripción a DNAc.

3. ¿Cuál es el objetivo de adicionar oligo d(T) para realizar la retrotranscripción?

El objetivo de utilizar oligo d(T) para realizar la retrotranscripción es que los oligo d (T) se alineen a la cola poli (A) presente en el RNAm, así seleccionamos el RNA que queremos (RNAm) del RNA total. Al unirse a la cola de poliAm los oligo d(T) actúan como cebadores para la enzima transcriptasa inversa, que sintetiza el cDNA complementario utilizando el RNAm como molde. De esta manera, los oligo d(T) que añadimos pueden permitir la síntesis selectiva de cDNA a partir del RNAm que seleccionamos.

¿Qué es el cDNA?

A nivel transcriptómico, el cDNA (ADN complementario) es una molécula fundamental. El cDNA se obtiene mediante la transcripción inversa, un proceso que implica la síntesis de una cadena de ADN complementaria basada en la secuencia de un ARN mensajero (ARNm) específico.

Estudio de la expresión génica: El cDNA se obtiene a partir de ARNm extraído de una muestra biológica, y representa una copia de la información genética presente en el ARNm. Por lo tanto, proporciona una representación de los genes que están siendo transcritos en una célula o tejido en un momento específico.

Análisis de perfiles de expresión: El cDNA se utiliza para analizar los perfiles de expresión génica, lo que permite a los investigadores comprender qué genes están activos o inactivos en una determinada condición o en respuesta a un estímulo específico.

Comparación de muestras: El cDNA se utiliza para comparar la expresión génica entre diferentes muestras, lo que puede revelar diferencias en la regulación génica en distintos contextos.

Identificación de nuevos transcritos: El cDNA se emplea para descubrir nuevos transcritos y genes, lo que contribuye a una comprensión más profunda del transcriptoma de una célula o tejido.

qPCR = PCR en tiempo real

Técnica con SybrGreen

1. Se usa una molécula que se llama SybrGreen (intercalante: tiene afinidad por ADN de doble hebra; inespecífica: se une a cualquier amplicón sin importar su secuencia) 2. Se une al ADN y emite fluorescencia (si hay amplificación, cada ciclo hay más ADN de doble cadena = más fluorescencia) a. Al final de cada ciclo el detector va a medir la cantidad de luz; cuando es poco intensa no se detecta si no hasta un cierto umbral de fluorescencia b. La detección se da en el Ct (ciclo en el que se alcanzó el umbral) i. Cuanto más ADN inicial hay en la muestra, más temprano se da el Ct ii. Puedo saber cuánto ADN había en la muestra por medio de la curva de calibración/standard

Ventajas de qPCR sobre la PCR de punto final

La qPCR permite cuantificar el ADN inicial que había en una muestra y el resultado es visible durante el proceso de la PCR, a medida que los ciclos se producen.

La PCR de punto final tiene ciertas limitantes: no se puede cuantificar el ADN en la muestra original y hay que conocer la secuencia específica que se quiere amplificar para diseñar los primers.

Referencias

SFPIE UV. (2018, 9 enero). 4.3. Retrotranscripción de ARN [Vídeo]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=TyDwjwUPwO0 ADNc. (2016, noviembre 14). Conogasi. https://conogasi.org/diccionario/adnc/ ADN complementario (cDNA). (2022, febrero 16). Gentaur España - Anticuerpos, Kits de PCR, Kits de ELISA; Gentaur. https://gentaur.es/conocimiento/adn-complementario-cdna ADNc (ADN copia). (s/f). Genome.gov. Recuperado el 30 de octubre de 2023, de https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/ADN-copia