L'interphase et la réplication de l'ADN

L'INTERPHASE

L'interphase est la phase la plus longue du cycle cellulaire. Elle se subdivise généralement en 3 étapes distinctes et de durée variable appelées Gap 1 (G1), S et Gap 2 (G2).

Dans une culture de cellules, on peut déterminer à quel moment de l'interphase se trouvent les cellules en étudiant les caractéristiques de leur noyau. Pour cela on étudie la quantité d'ADN présente à l'aide d'iodure de propidium, marqueur fluorescent qui se fixe spécifiquement entre les bases azotées de chaque molécule d'ADN.

Dans une culture de cellules humaines, toutes les cellules ne sont pas synchrones ; elles sont chacune à un moment différent de l'interphase. On les marque à l'iodure de propidium puis on analyse la fluorescence et le diamètre de chacune. Les résultats sont reportés dans un graphique dans lequel chaque cellule est représentée par un point. La fluorescence mesurée est directement proportionnelle à la quantité d'ADN dans la cellule.

La phase S

On réalise une culture de cellules humaines dont le cycle cellulaire est synchrone. Leur temps de génération de 24 heures se répartit ainsi :

• G1 = 12h
• S = 6h
• G2 = 5h
• Mitose = 1h

Interphase

Résultats expérimentaux du marquage à l'iodure de propidium d'une culture cellulaire synchrone.

Temps (heure)

Une fraction de cette culture est régulièrement prélevée au cours d'un cycle cellulaire complet, puis les cellules sont marquées à l'iodure de propidium. La fluorescence moyenne des cellules est alors quantifiée.

La phase G1

La durée de la phase G1 est très variable d'un type de cellule à un autre. Elle est quasi-nulle pour une cellule-oeuf en division et peut atteindre plusieurs mois pour des cellules à multiplication lente (ex : cellule du foie).D'une manière générale, les cellules d'un organisme passent la majeure partie de leur vie en phase G1. Les techniques actuelles permettent de mesurer précisément la masse et le volume de chaque cellule d'une population, puis d'analyser leur contenu moléculaire par microspectroscopie. On suit l'évolution de ces paramètres dans une population de levure de bière (Saccharomyces cerevisiae)

Interphase

La phase G2

Interphase

Au cours de la phase G2, la cellule continue à croître, mais cette phase se caractérise principalement par une modification des organites cellulaires, comme les mitochondries et les chloroplastes.

Des études ont permis de suivre l'évolution du volume total des mitochondries dans des cellules en division d'un végétal : l'arabette des dames (Arabidopsis thaliana).

Que se passe-t-il au cours de la phase S ?

L'expérience de Meselson et Stahl (1958)

L'azote est un constituant majeur de l'ADN. L'azote 14 (14N) en est, de loin, l'isotope le plus répandu sur Terre, contrairement à l'azote 15 (15N) considéré comme "lourd". Ce dernier n'est pas radioactif, juste plus lourd que l'isotope commun, car il contient un neutron supplémentaire.

• De l'ADN dont tous les atomes d'azote sont des 15N est donc globalement plus lourd que de l'ADN dont tous les atomes d'azote sont des 14N.
• On parle donc d'ADN "lourd" et d'ADN "léger". Cette différence a des conséquences sur la position des molécules d'ADN dans le tube suite à la centrifugation sur gradient de densité.
• Les 3 hypothèses avec l'expérience de Meselson et Stahl

protocole

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Protocole pour la modélisation de la réplication de l'ADN

Préparation du gradient de concentration du milieu de migration de l’ « ADN » modélisé par des colorants.

Le gradient de concentration doit être préparé dans 3 tubes à essai différents.

• Verser dans un tube à essai, 1 mL de solution de saccharose 65% avec une pipette de 1 mL
• Verser délicatement, goutte à goutte, tube incliné presque à l’horizontale sans relever le tube à la fin, au-dessus de la solution précédente, 1 mL de solution de saccharose 45%.
• Recommencer de la même manière avec la solution de saccharose 25%, puis celle à 0%.

Remarque : vous devez pouvoir distinguer les limites des différentes solutions à l’œil nu.

Modélisation des résultats obtenus avec des bactéries mises en culture sur milieu 14N et 15N.

• Dans un 1er tube à essai et toujours en maintenant le tube presque à l’horizontale, verser au goutte à goutte très délicatement 0,5 mL d’ADN (produit substitutif bleu) obtenu après culture sur milieu 15N et extraction de l’ADN.
• Dans un 2ème tube à essai, verser de la même manière 0,5 mL d’ADN (produit substitutif jaune) obtenu après culture sur milieu 14N et extraction de l’ADN.
• Dans un 3ème tube à essai, verser de la même manière 0,5 mL d’ADN (produit substitutif rouge) obtenu après 1 cycle cellulaire (=1 génération) sur milieu 14N et extraction de l’ADN.

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Les lipides et les protéines sont les principaux composants des membranes cellulaires.

les 3 hypothèses sur la réplication de l'ADN dans les années 1950