Universidad Autónoma de Nuevo LeónFacultad de Ciencias Biológicas Lic. Biotecnología Genómica
Terapia GénicaDocente: Elda Josefina Robles Sierra
Actividad 1Dossier de vectores virales y no virales
Grupo 481 1601187 Edgar Eduardo Parga Vidaña
San Nicolás de los Garza, Nuevo León 10 de Septiembre de 2023
Terapia Génica
La terapia génica es una alternativa al uso de fármacos convencionales para el tratamiento de todo tipo de enfermedades (genéticas, adquiridas, etc.) a través de la manipulación de la genética del propio paciente o mediante la introducción de material genético externo por medio de vectores.
Tipos de vectores
Existen diversos tipos de vectores, los cuales se pueden clasificar de la siguiente manera:
Vectores virales
Vectores no virales
Vectoresno virales
Este tipo de vectores entregan el material de interés utilizando sistemas físicos o químicos, son los más sencillos, seguros, económicos y más fáciles de producir a gran escala; aunque cuentan con una gran capacidad de carga, la eficacia de transfección es menor en comparación con los vectores virales.
Vectores físicos
Dentro de los vectores físicos se encuentran múltiples técnicas como la microinyección, biobalística (microproyectiles y electroporación), sonoporación, fotoporación, magnetofección, hidroporación y la entrega por DNA desnudo.
Microinyección
Uno de los métodos físicos más utilizados, se realiza penetrando las membranas celulares con una aguja fina inyectando el material deseado, de manera manual o asistida por tecnología. Usada comúnmente para producción de alimentos transgénicos.
Ventajas
- Alta eficiencia de administración y nula toxicidad.
Desventajas
- Método tardado, transitorio, una célula a la vez.
Biobalística - Microproyectiles
Se basa en un bombardeo a gran velocidad de perlas o partículas recubiertas del material deseado contra las células, perforan e introducen el agente al núcleo. Utilizado comúnmente para elaborar plantas transgénicas.
Ventajas
- Procedimiento sencillo y de eficiencia regular.
Desventajas
- Produce muerte celular, transitorio.
Biobalística - Electroporación
Uso de pulsos eléctricos de 200 V/cm que permean las membranas induciendo la formación de poros hidrofílicos.
Ventajas
- De fácil manejo, tejidos variados, in vitro e in vivo.
Desventajas
- Eficacia baja, transitorio, cambios en el voltaje producen muerte celular.
Sonoporación
Uso de ondas ultrasónicas que alteran la estabilidad de la membrana plasmática generando poros temporalmente, en los cuales se introduce el material deseado.
Ventajas
Desventajas
- Eficacia baja, transitorio.
Fotoporación
Uso de pequeños sensibilizadores fototérmicos de nanopartículas adheridos a las superficies celulares que crean permeabilización de membrana mediante calentamiento por láseres.
Ventajas
- Alta eficiencia de administración y nula toxicidad.
Desventajas
- Método transitorio, selectivo de tejidos.
Magnetofección
Partículas magnetizadas recubiertas del material deseado, perforan e introducen el agente al núcleo de manera dirigida aplicando un campo magnético.
Ventajas
- Procedimiento sencillo y de eficiencia regular.
Desventajas
- Produce muerte celular, transitorio.
Hidroporación
Uso de presión hidrostática que permite que el material de interés atraviese las uniones de las células endoteliales, induciendo su separación, y posteriormente determina la formación transitoria de poros.
Ventajas
- Invasivo, tejidos variados, in vivo.
Desventajas
- Eficacia baja, transitorio.
DNA Desnudo
Este método no requiere moléculas externas al ADN para su protección y dirección (exceptuando soluciones salinas o séricas), pensado comúnmente para vacunas.
Ventajas
- Simplicidad de producción y uso.
- Uso potencial como vacunas genéticas.
- Desventajas
- Eficacia baja, transitorio.
Vectores químicos
Soluciones acarreadoras de moléculas como lo puede ser el fosfato de calcio, el cual crea una formación de un precipitado de ADN, facilitando la adhesión del ADN con la superficie de la célula para que el material genético entre mediante endocitosis o fagocitosis.
Ventajas
- Económico, no genera toxicidad, utilizado en cultivos celulares ex vivo.
Desventajas
- Muy baja eficacia (aproximadamente el 10%)
- Expresión transitoria
Variaciones de mejoramiento
La eficacia de estos procesos puede ser muy baja si se utilizan por separado, por lo que es común realizar combinaciones de las técnicas previamente descritas para otorgar un mayor rango de éxito, inclusive a igualar la eficiencia de vectores virales, sin llevar las desventajas que estos conllevan como la activación de la respuesta inmunitaria.
Vectoresno virales de fusión
Moléculas que acarrean fármacos o material genético mediante la encapsulación, interacciones electrostáticas, relaciones receptor-ligando o aglomerados en formaciones dendríticas que liberan el material bajo distintas condiciones, como la unión de membranas, cambios en el pH, etc., ejemplos son liposomas, dendrímeros y biopolímeros.
Liposomas
Estructuras esféricas compuestas por una bicapa de lípidos que encapsulan el material de interés, con estructura similar a las membranas celulares que permiten la fusión por endocitosis y la liberación del material.
Ventajas
- Protección del ADN por las nucleasas, baja toxicidad.
Desventajas
- Baja eficacia (10% aprox.), degradación por lisosimas, transitorio.
Polímeros catiónicos
Los polímeros catiónicos suelen llevar un grupo de amina protonable, son estructuras que pueden ser lineales, ramificadas o dendríticas, se une al ADN e induce su condensación debido a la carga positiva que estos conllevan, ingresan a la célula mediante endocitosis.
Ventajas
- Formulación y aplicación sencilla y eficacia regular.
Desventajas
- Expresión transitoria y potencial actividad nefrotóxica.
Dendrímeros
Dentro de los polímeros catiónicos se encuentran los dendrímeros, polímeros de alta importancia, cuentan con un centro definido de donde se origina una estructura ramificada y repetitiva. Cuentan con una gran capacidad de almacenaje y tienen múltiples funciones.
Ventajas
- Formulación y aplicación sencilla, alta solubilidad, gran capacidad de carga y alta eficacia de 50% aprox.
Desventajas
- Expresión transitoria y potencial actividad nefrotóxica.
Biopolímeros
Macromoléculas de proteínas, ácidos grasos y aminoácidos procedentes de organismos vivos compuestos. Dentro de estos se encuentran el polietilenoglicol (PEG) y el poli-L-lisina (PLL).
Ventajas
- Gran biocompatibilidad, casi nula toxicidad e inmunogenicidad y una gran solubilidad.
Desventajas
Endocitosis y como ocurre
La endocitosis es un mecanismo celular que ocurre en condiciones fisiológicas cuando un elemento ajeno es envuelto por la membrana plasmática formando una vesícula, viajando al interior de la célula donde posteriormente el contenido es liberado debido a las condiciones establecidas en el interior celular.
Fagocitosis
La fagocitosis es la ingesta de partículas grandes donde receptores en la superficie celular se unen a los cuerpos extraños, otorgando señales intracelulares para reorganizar el citoesqueleto de actina para engullir la partícula, lo que finalmente resulta en la formación de una gran vacuola conocida como fagosoma.
Macropinocitosis
De manera similar a la fagocitosis, la macropinocitosis implica la absorción de agentes externos, pero en su mayoría implicado a líquidos y solutos disueltos.
Endocitosis mediada por clatrinas
La endocitosis mediada por clatrinas es un evento más específico en donde la membrana plasmática forma una cavidad hacia dentro para formar una vesícula pequeña recubierta por clatrinas, donde una vez dentro se disocian debido al pH ácido.
Endocitosis caveolar
la endocitosis caveolar es un proceso similar a la endocitosis mediada por clatrinas, con la diferencia de que independiente de la clatrina, en su lugar se utiliza caveolina para las pequeñas vesículas, las cuales se fusionan ffinalmente con el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi, entregando así su contenido a estos compartimentos.
Vectores virales
Los vectores virales son virus modificado en esencia, los cuales son utilizados para acarrear material genético dentro de ellos, los cuales les permiten tener grandes beneficios en comparación con los vectores no virales, como el alto porcentaje de eficacia y la solubilidad, pero algunos presentan algunas deficiencias como su naturaleza de activar la respuesta inmunitaria e inflamatoria. La mayoría se trabaja en in vivo y ex vivo.
Retrovirus
Pertenecen a la famila Retroviridae, virus de cadena sencilla de RNA con transciptasa reversa, los cuales fueron pioneros en el uso de terapia génica. Contiene 3 genes esenciales, los cuales son los genes Gag, Pol y Env, que codifican para el empaquetamiento, la enzima polimerasa y para la envoltura de nuevos virus principalmente. Estos pueden integrarse al genoma y causar defectos.
Gammaretrovirus
Pertenecientes a la familia de los retrovirus, el MLV ha sido ampliamente utilizado como vector en estudios de terapia génica y como modelo para investigar la oncogénesis y la integración viral en el genoma de las células huésped.
Variantes de contrucción
Lentivirus
Estos virus son pertenecientes a la familia de los retrovirus, son conocidos por su capacidad para infectar y destruir las células del sistema inmunológico, en particular los linfocitos T CD4+, lo que los convierte en agentes causantes del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Virus silvestre y generaciones de vectores
Adenovirus
Virus de ADN ampliamente desarrollados en terapia génica que pertenecen a la familia Adenoviridae. Los vectores basados en este virus están delecionados en al menos la región temprana E1, la cual es esencial para la replicación. Posee genes tempranos (replicación) E1, E2, E3 y E4, y genes tardíos (componentes estructurales)L1, L2, L3, L4 y L5. Empacan más de 30 Kb de genes exógenos.
Variantes de contrucción
Producción
Adenoasociados
Pertenecientes a la familia Parvoviridae, son virus no patógenos con un ADN lineal de cadena sencilla de 4,7 kb, que requiere de la presencia de un virus auxiliar o helper, tipo adenovirus para su replicación. De genoma sencillo y codifica solamente para dos genes: REP (Replicación) y CAP (Cápside). Su ADN terminal consiste en ITR que forman una estructura de horquilla en forma de T.
Virus silvestre y generaciones de vectores
Producción
Literatura consultada
• Chi, Z., Xu, Q., & Zhu, L. (2020). A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access, 8, 8520-8532.
• Compostizo, R. P. (2019). NANOPARTÍCULAS PARA TERAPIA GÉNICA.
• Fernández Muro, P. (2023). Diseño y evaluación de vectores no virales para terapia génica combinada en la enfermedad de Fabry.
• Giacca, M. (2010). Gene therapy. Springer Science & Business Media.
• Kumar, A. (2021). Photoporation developed as an effective nonviral gene delivery system.
• Lacroix, B., & Citovsky, V. (2020). Biolistic approach for transient gene expression studies in plants. Biolistic DNA delivery in plants: Methods and protocols, 125-139.
• Zu, H., & Gao, D. (2021). Non-viral vectors in gene therapy: Recent development, challenges, and prospects. The AAPS journal, 23(4), 78.
Vectores virales y no virales
Edgar Parga
Created on September 10, 2023
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Universidad Autónoma de Nuevo LeónFacultad de Ciencias Biológicas Lic. Biotecnología Genómica
Terapia GénicaDocente: Elda Josefina Robles Sierra
Actividad 1Dossier de vectores virales y no virales
Grupo 481 1601187 Edgar Eduardo Parga Vidaña
San Nicolás de los Garza, Nuevo León 10 de Septiembre de 2023
Terapia Génica
La terapia génica es una alternativa al uso de fármacos convencionales para el tratamiento de todo tipo de enfermedades (genéticas, adquiridas, etc.) a través de la manipulación de la genética del propio paciente o mediante la introducción de material genético externo por medio de vectores.
Tipos de vectores
Existen diversos tipos de vectores, los cuales se pueden clasificar de la siguiente manera:
Vectores virales
Vectores no virales
Vectoresno virales
Este tipo de vectores entregan el material de interés utilizando sistemas físicos o químicos, son los más sencillos, seguros, económicos y más fáciles de producir a gran escala; aunque cuentan con una gran capacidad de carga, la eficacia de transfección es menor en comparación con los vectores virales.
Vectores físicos
Dentro de los vectores físicos se encuentran múltiples técnicas como la microinyección, biobalística (microproyectiles y electroporación), sonoporación, fotoporación, magnetofección, hidroporación y la entrega por DNA desnudo.
Microinyección
Uno de los métodos físicos más utilizados, se realiza penetrando las membranas celulares con una aguja fina inyectando el material deseado, de manera manual o asistida por tecnología. Usada comúnmente para producción de alimentos transgénicos.
Ventajas
- Alta eficiencia de administración y nula toxicidad.
DesventajasBiobalística - Microproyectiles
Se basa en un bombardeo a gran velocidad de perlas o partículas recubiertas del material deseado contra las células, perforan e introducen el agente al núcleo. Utilizado comúnmente para elaborar plantas transgénicas.
Ventajas
- Procedimiento sencillo y de eficiencia regular.
DesventajasBiobalística - Electroporación
Uso de pulsos eléctricos de 200 V/cm que permean las membranas induciendo la formación de poros hidrofílicos.
Ventajas
- De fácil manejo, tejidos variados, in vitro e in vivo.
DesventajasSonoporación
Uso de ondas ultrasónicas que alteran la estabilidad de la membrana plasmática generando poros temporalmente, en los cuales se introduce el material deseado.
Ventajas
- Procedimiento sencillo.
DesventajasFotoporación
Uso de pequeños sensibilizadores fototérmicos de nanopartículas adheridos a las superficies celulares que crean permeabilización de membrana mediante calentamiento por láseres.
Ventajas
- Alta eficiencia de administración y nula toxicidad.
DesventajasMagnetofección
Partículas magnetizadas recubiertas del material deseado, perforan e introducen el agente al núcleo de manera dirigida aplicando un campo magnético.
Ventajas
- Procedimiento sencillo y de eficiencia regular.
DesventajasHidroporación
Uso de presión hidrostática que permite que el material de interés atraviese las uniones de las células endoteliales, induciendo su separación, y posteriormente determina la formación transitoria de poros.
Ventajas
- Invasivo, tejidos variados, in vivo.
DesventajasDNA Desnudo
Este método no requiere moléculas externas al ADN para su protección y dirección (exceptuando soluciones salinas o séricas), pensado comúnmente para vacunas.
Ventajas
Vectores químicos
Soluciones acarreadoras de moléculas como lo puede ser el fosfato de calcio, el cual crea una formación de un precipitado de ADN, facilitando la adhesión del ADN con la superficie de la célula para que el material genético entre mediante endocitosis o fagocitosis.
Ventajas
- Económico, no genera toxicidad, utilizado en cultivos celulares ex vivo.
DesventajasVariaciones de mejoramiento
La eficacia de estos procesos puede ser muy baja si se utilizan por separado, por lo que es común realizar combinaciones de las técnicas previamente descritas para otorgar un mayor rango de éxito, inclusive a igualar la eficiencia de vectores virales, sin llevar las desventajas que estos conllevan como la activación de la respuesta inmunitaria.
Vectoresno virales de fusión
Moléculas que acarrean fármacos o material genético mediante la encapsulación, interacciones electrostáticas, relaciones receptor-ligando o aglomerados en formaciones dendríticas que liberan el material bajo distintas condiciones, como la unión de membranas, cambios en el pH, etc., ejemplos son liposomas, dendrímeros y biopolímeros.
Liposomas
Estructuras esféricas compuestas por una bicapa de lípidos que encapsulan el material de interés, con estructura similar a las membranas celulares que permiten la fusión por endocitosis y la liberación del material.
Ventajas
- Protección del ADN por las nucleasas, baja toxicidad.
DesventajasPolímeros catiónicos
Los polímeros catiónicos suelen llevar un grupo de amina protonable, son estructuras que pueden ser lineales, ramificadas o dendríticas, se une al ADN e induce su condensación debido a la carga positiva que estos conllevan, ingresan a la célula mediante endocitosis.
Ventajas
- Formulación y aplicación sencilla y eficacia regular.
DesventajasDendrímeros
Dentro de los polímeros catiónicos se encuentran los dendrímeros, polímeros de alta importancia, cuentan con un centro definido de donde se origina una estructura ramificada y repetitiva. Cuentan con una gran capacidad de almacenaje y tienen múltiples funciones.
Ventajas
- Formulación y aplicación sencilla, alta solubilidad, gran capacidad de carga y alta eficacia de 50% aprox.
DesventajasBiopolímeros
Macromoléculas de proteínas, ácidos grasos y aminoácidos procedentes de organismos vivos compuestos. Dentro de estos se encuentran el polietilenoglicol (PEG) y el poli-L-lisina (PLL).
Ventajas
- Gran biocompatibilidad, casi nula toxicidad e inmunogenicidad y una gran solubilidad.
DesventajasEndocitosis y como ocurre
La endocitosis es un mecanismo celular que ocurre en condiciones fisiológicas cuando un elemento ajeno es envuelto por la membrana plasmática formando una vesícula, viajando al interior de la célula donde posteriormente el contenido es liberado debido a las condiciones establecidas en el interior celular.
Fagocitosis
La fagocitosis es la ingesta de partículas grandes donde receptores en la superficie celular se unen a los cuerpos extraños, otorgando señales intracelulares para reorganizar el citoesqueleto de actina para engullir la partícula, lo que finalmente resulta en la formación de una gran vacuola conocida como fagosoma.
Macropinocitosis
De manera similar a la fagocitosis, la macropinocitosis implica la absorción de agentes externos, pero en su mayoría implicado a líquidos y solutos disueltos.
Endocitosis mediada por clatrinas
La endocitosis mediada por clatrinas es un evento más específico en donde la membrana plasmática forma una cavidad hacia dentro para formar una vesícula pequeña recubierta por clatrinas, donde una vez dentro se disocian debido al pH ácido.
Endocitosis caveolar
la endocitosis caveolar es un proceso similar a la endocitosis mediada por clatrinas, con la diferencia de que independiente de la clatrina, en su lugar se utiliza caveolina para las pequeñas vesículas, las cuales se fusionan ffinalmente con el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi, entregando así su contenido a estos compartimentos.
Vectores virales
Los vectores virales son virus modificado en esencia, los cuales son utilizados para acarrear material genético dentro de ellos, los cuales les permiten tener grandes beneficios en comparación con los vectores no virales, como el alto porcentaje de eficacia y la solubilidad, pero algunos presentan algunas deficiencias como su naturaleza de activar la respuesta inmunitaria e inflamatoria. La mayoría se trabaja en in vivo y ex vivo.
Retrovirus
Pertenecen a la famila Retroviridae, virus de cadena sencilla de RNA con transciptasa reversa, los cuales fueron pioneros en el uso de terapia génica. Contiene 3 genes esenciales, los cuales son los genes Gag, Pol y Env, que codifican para el empaquetamiento, la enzima polimerasa y para la envoltura de nuevos virus principalmente. Estos pueden integrarse al genoma y causar defectos.
Gammaretrovirus
Pertenecientes a la familia de los retrovirus, el MLV ha sido ampliamente utilizado como vector en estudios de terapia génica y como modelo para investigar la oncogénesis y la integración viral en el genoma de las células huésped.
Variantes de contrucción
Lentivirus
Estos virus son pertenecientes a la familia de los retrovirus, son conocidos por su capacidad para infectar y destruir las células del sistema inmunológico, en particular los linfocitos T CD4+, lo que los convierte en agentes causantes del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Virus silvestre y generaciones de vectores
Adenovirus
Virus de ADN ampliamente desarrollados en terapia génica que pertenecen a la familia Adenoviridae. Los vectores basados en este virus están delecionados en al menos la región temprana E1, la cual es esencial para la replicación. Posee genes tempranos (replicación) E1, E2, E3 y E4, y genes tardíos (componentes estructurales)L1, L2, L3, L4 y L5. Empacan más de 30 Kb de genes exógenos.
Variantes de contrucción
Producción
Adenoasociados
Pertenecientes a la familia Parvoviridae, son virus no patógenos con un ADN lineal de cadena sencilla de 4,7 kb, que requiere de la presencia de un virus auxiliar o helper, tipo adenovirus para su replicación. De genoma sencillo y codifica solamente para dos genes: REP (Replicación) y CAP (Cápside). Su ADN terminal consiste en ITR que forman una estructura de horquilla en forma de T.
Virus silvestre y generaciones de vectores
Producción
Literatura consultada
• Chi, Z., Xu, Q., & Zhu, L. (2020). A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access, 8, 8520-8532. • Compostizo, R. P. (2019). NANOPARTÍCULAS PARA TERAPIA GÉNICA. • Fernández Muro, P. (2023). Diseño y evaluación de vectores no virales para terapia génica combinada en la enfermedad de Fabry. • Giacca, M. (2010). Gene therapy. Springer Science & Business Media. • Kumar, A. (2021). Photoporation developed as an effective nonviral gene delivery system. • Lacroix, B., & Citovsky, V. (2020). Biolistic approach for transient gene expression studies in plants. Biolistic DNA delivery in plants: Methods and protocols, 125-139. • Zu, H., & Gao, D. (2021). Non-viral vectors in gene therapy: Recent development, challenges, and prospects. The AAPS journal, 23(4), 78.