DOSSIER GENIAL

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

UA: Terapia génica

Vectores virales y no virales

Facilitador : ELDA JOSEFINA ROBLES SIERRA

Monica Alejandra Rueda Noy 2034733

Grupo: 481

Son los medios transportadores ó "vehículos" que permiten introducir el material genético de interés a una amplia variedad de células, tejidos, órganos completos, etc.

Vectores

Existe una gran veriedad de vectores y estos se clasifican en :

¿De qué depende un vector óptimo?

1. El tamaño del material genético dentro del vector de expresión 2. La duración de la expresión 3. Las células dianas y características

VECTORES NO VIRALES

VECTORES VIRALES

- Físicos- Químicos - De fusión - De endocitosis

Vectores no virales

Los vectores no virales al igual que los virales son utilizados para la entrega de material genético a células. Estos no tienen el riesgo de presentar problemas de inmunogenicidad, algunos ejemplos son la inyección de ADN desnudo, basados en partículas y químicos, etc.

Estos se clasifican en:Físicos/Químicos/Por endocitosis/De fusión

VENTAJAS

Se puede realizar una transferencia de genes grandesEspecificidad de sitio Seguridad considerablemente mayor a los vectores no virales No toxicas

DESVENTAJAS

Su nivel de expresión es pobre Tienen una baja eficiencia de transfección

Vectores químicos

FOSFATO DE CALCIO

Fundamento

Producción

Los iones de calcio presentan la capacidad de precipitar el ADN provocando que la célula, mediante endocitosis, pueda introducir el material genético en el interior.

1. El material genético (DNA) se mantiene en una solución con cloruro de calcio.2. Se combina mediante el empleo de buffer de fosfatos para logar la precipitación del material

DESVENTAJAS

VENTAJAS

Su nivel de expresión es pobre Tienen una baja eficiencia de transfección

- No presenta toxicidad- Fácil de producir y con un bajo costo

Mejoramiento

Uso de kit comerciales como: Kit de transfección de fosfato de calcio (invitrogen)

Vectores físicos

MICROINYECCIÓN

Fundamento

Se basa en la introducción de ADN por medio de una inyección directamente en el núcleo de las células con la ayuda de un micromanipulador.Es empleado en organismos transgénicos, introducción de RNA antisentido, entre otros.

Producción

1. En una micropipeta de 0,1 micras de vidrio se coloca el transgén2. Se introduce la punta en la célula y se inyecta el material

DESVENTAJAS

VENTAJAS

- Costos altos - Es una técnica que necesita un equipo altamente especializado - Presenta poca eficiencia

- Alta eficacia de transfección Preciso - Puede ser usada en invertebrados - De forma In vitro es usado en embriones

Uso de equipo especializado (micromanipulador)

Mejoramiento

Bombas de inyección: Simplificación de la inyección intracelular por medio del Picopump neumáticos PV820/PV830.

Vectores físicos

MAGNETOFECCIÓN

Fundamento

Se basa en ejercer una fuerza magnética sobre los vectores genéticos asociados a partículas especificas que han se encuentran magnificadas, lo que induce una fuerza de atracción de los vectores hacia las células objetivo.

Producción

1. Se agregan partículas catiónicas al plásmido problema.2. En un mismo buffer se introducen ambos. 3. En la placa se coloca un equipo magnético para generar impulsos e introducir a la fuerza el material a la célula.

VENTAJAS

- Sencillez y eficacia- La transfección se da en pocos minutos

DESVENTAJAS

- Puede producir muerte celular - Baja eficiencia

Vectores físicos

DNA DESNUDO

Fundamento

El ADN es transportado en solución salina o sérica por medio de una inyección intramuscular (inyección directa al músculo).

Producción

VENTAJAS

- Es directo, simple y económico. - Nula integración al genóma. - Buenos para el uso de ciertos tejidos (timo, musculo) - Baja toxicidad

1. Introducción del material en solución salina o sérica2. Inyección directa de la solución sobre el tejido 3. El material es endocitado a través del poro nuclear

DESVENTAJAS

- Presenta un porcentaje bajo de transfección. - Su expresión génica es corta

Vectores físicos

BIOBALÍSTICA

Fundamento

Producción

Consiste en la transferencia de manera directa de genes en una célula, mediante la propulsión a una alta velocidad (microesferas de metal cubiertas de ADN), esto con un equipo llamado cañón de ADN. La fuerza física del impacto supera la barrera de la membrana celular. Se emplea en: Transformación de células vegetales, transgénicos, etc

1. Sobre una bala de metal de un micrón (oro o tungsteno) colocar el material genético.2. Disparar el proyectil por medio de una pistola de genes. 3. Esta técnica tiene la capacidad de penetrar hasta 20 capas de células

VENTAJAS

DESVENTAJAS

- Equipo costoso - Transfección variable - Posible muerte celular en el proceso - Expresión transitoria Integración de solo 10-8 de células expuestas

- Ahorro de pasos - Fácil manejo - Permite transformar organelos celulares como mitocondrias de modo reproducible - Un único disparo puede producir integraciones múltiples.

Mejoramiento

Modificaciones en el promotor, y el manejo de las células una vez introducido el material genético.

Vectores físicos

ELECTROPORACIÓN

Fundamento

Permeabiliza las membranas, mediante el aumento significativo de la conductividad eléctrica, causado por un campo eléctrico aplicado. Las membranas se desestabilizan lo que origina la perdida temporal de la permeabilidad, lo que produce poros reversibles.Introduce la construcción génica mediante pulso electrico de aprox. 200V/cm.

Producción

1. Preparar las células junto con el plásmido del transgén en buffer (Se puede emplear la enzima Hialuronidasa para aumentar su eficacia)2. Se aplica un pulso eléctrico en el electroporador (200 v/cm)

DESVENTAJAS

VENTAJAS

- Muerte celular - Expresión transitoria - Eficiencia baja.* Si se utiliza hialuronidasa aumenta.

- Uso in vivo e in vitro- Aislamiento de células para control de calidad.

Mejoramiento

Nucleofeccion: EL plásmido es depositado en el núcleo lo que ayuda mejorar la eficacia en células difíciles

Vectores físicos

SONICACIÓN

Fundamento

Empleo de ultrasonido con frecuencias altas (superiores a 20 KHz), lo cual genera permeabilidad en las membranas, mediante la introducción de poros transitorios, por lo que el material genético puede ingresar al interior de la célula.

Producción

VENTAJAS

1. Se introduce la muestra dentro del sonificador, a lo cual se someterá a ultrasonidos con altas frecuencias.2. Esto en presencia del vector, no debe superar los 15 minutoS

- Bajo costo- Simplicidad de uso y equipo Incremento en la permeabilidad

DESVENTAJAS

- Baja eficiencia

Vectores de fusión

LIPOSOMAS

VENTAJAS

Fundamento

- No hay límite de tamaño - Simple manufactura - No daña a la célula - Protege al DNA

Los liposomas son “perlas” de lípidos que contienen un ADN plasmídico en el que se encuentra el gen terapéutico con todas las señales de secuencia necesarias para su expresión en el destino celular de elección. Son creados por sonicación de fosfolípidos en agua.

DESVENTAJAS

- Cristalización de lípidos - Cinéticas variables - Baja eficacia de tranfección

Vectores de fusión

POLIMEROS

VENTAJAS

Fundamento

- Biocompatibilidad - Poca inmunogenicidad - Aumenta el tiempo en el liposoma - No permite que se formen agregados

Macromoleculas formada por monómeros gracias al proceso de polimerizacion. Utilizan el mismo principio que liposomas. También se les da el nombre de Liposomas no lipídicos. Complejo DNA + Polímero (Poliplex)

Clasificación

PEG (poli-etileno-glicol)

DESVENTAJAS

Estabilizador estérico que aumenta la biodisponibilidad en sangre

- Baja solubilidad en algunos medios específicos - No puede liberar el material dentro del citoplasma

Mejoramiento

PLL (poli-L-lisina)

Sitio-especifico en la adición de un promotor o receptorUnión con un policatión conjugado para aumentar la eficiencia

Polímero catiónico

Vectores de endocitosis

DENDRÍMEROS

Fundamento

Macromoléculas poliméricas sintéticas con periferia de carga positiva, estas están compuestas de múltiples brazos monoméricos. Son moléculas similares a las proteínas, por lo que ofrece un tipo de interacción con sistemas biológicos.

Componentes: tránsgen y Dendrónes

Producción

1. Se preparan los dendrímeros utilizando un método divergente o uno convergente. 2. (Divergente) el dendrímero crece hacia el exterior a partir de una molécula central multifuncional. 3. La molécula central reacciona con moléculas de monómero que contienen un grupo reactivo y dos latentes, lo que da lugar al dendrímero de primera generación. 4. Posteriormente la nueva periferia de la molécula se activa para reacciones con más monómeros.

VENTAJAS

- Robusta construcción covalente.- Control de estructura y tamaño. - Toxicidad baja tanto in vitro como in vivo. - Inhiben las nucleasas dependientes de pH. - Presenta una transfección del 50%

DESVENTAJAS

- Algunos como PAMAM muestran baja estabilidad durante la esterilización por calor - Mientras más grande la molécula mas toxicidad generará pero es más estable.

- Uso de varios redicales para aumentar la biocompatibilidad- Diferentes estrategias de modulacion estructural para reducir la citotoxicidad.

Mejoramiento

Vectores virales

Partículas de virus no competentes que han sido modificadas con la introducción de un transgen con el fin de generar una respuesta en el organismo.

OBJETIVO

- Entrega del transgen (gen terapéutico) en el núcleo de la célula blanco por interacción específica con receptores celulares; mediado por endocitosis

VECTORES DE USO COMÚN

Retrovirus, adenovirus, adenoasociados

Para poderse multiplicar y llegar a la célula blanco, es necesario que el vector viral tenga secuencias de regulación en el transgen, además de señales de replicación y empaquetamiento.

Vectores virales

RETROVIRUS

La replicación de estos vectores se obtiene remplazando las regiones codificadoras para las proteínas estructurales gag, pol y env por el gen de interés, lo que permite la incorporación de cADN.

Utilizados ex vivo.

VENTAJAS

- Permanente- Se puede usar alta concentración viral

DESVENTAJAS

- Se pueden insertar en lugares oncogénicos - Pobre eficacia - No infecta células no divididas

RETROVIRUS

Vectores virales

GAMMARETROVIRUS

Producción

Transfectar a una linea celular de empaquetamiento lo cual es de origen murino, en la linea celular se tienen que expresar los genes deletados anteriormente gag, pol, env.

1. Generación del vector con el transgen para transfectar a célula empaquetadora. El vector del transgen contiene señal empaquetadora.2. En la célula empaquetadora se expresa los genes gag, pol y env. 3. El vector solo es capaz de tener un solo ciclo de infección.

VENTAJAS

Para la célula empaquetedora

- Uso simpleAlta eficacia de transfección Se integra en el genoma (también puede ser desventaja) - Expresión permanente (dura meses)

Es un cultivo donde se expresan las proteínas virales para propagar al vector. Generalmente se emplean células de murino (Mo-MLV tiene dos variantes de proteínas de superficie).

Genoma viral

Elementos que se conservan

DESVENTAJAS

- Infecciones por recombinación de virus Capacidad de tamaño (8kb, no más de 8.5) Casi siempre solo uso ex vivo Mutagénesis en sitios pro-oncogénicos

Vector del transgen

LTRs (U3 R U5). PBS: Transcripción inversa. SA y SD: Sitios de Splice Señal de empaquetamiento PPT: Sitio de polipurinas

RETROVIRUS

Vectores virales

LENTIVIRUS

Se basa en el virus HIV-1. Existen 3 generaciones de vectores debido a las mejoras que se le han hecho. Se transfectan en células HEK293 (se utilizan por excelencia en empaquetamiento).

DESVENTAJAS

VENTAJAS

- Generación de partículas competentes. - Mutagénisis por integración aleatoria de LTRs. - Recombinación

- Capaz de transfectar en células no en división- Uso in vivo

Producción

Se necesitan 3 plásmidos (1 vector de transgén y 2 vectores de empaquetamiento). Los de empaquetamiento necesitan un promotor fuerte y el tercer plásmido se hace con el virus de estomatitis vesicular.

Vectores virales

ADENOVIRUS

Consideraciones

Son virus sin envoltura , icosaédricos, que miden entre 69-90 nm. Los Ad2 y Ad5 son los más utilizados como vectores génicos. No se integran al genoma, por lo tanto expresan el transgén de forma temporal.

Su genoma tiene genes tempranos y tardíos. Son los vectores más inmunogénicos; se tienen respuestas FUERTES. Responsables de resfriados, gastritis y conjuntivitis.

VENTAJAS

- Puede infectar células no divididas- Pueden insertar hasta 20 kb de gen

DESVENTAJAS

- Se pueden insertar en lugares oncogénicos - Cierto grado de inmunogénicidad - Generación de partículas competentes. Oncogénicos.

Vectores virales

ADENOVIRUS

Primera generación del transgen

Segunda generación del transgen

Elementos que se conservan

- ITRs.-Señal de empaquetamiento. - Remoción de E1, E2, E3 Y E4. - Promotor. - Sitio de Poliadenilación.

Elementos que se conservan

- Tienen replicación deficiente in vivo. - Fuerte Respuesta Inflamatoria. - Ad2 y Ad5 son los más utilizados.

- ITRs.-Señal de empaquetamiento. - Remoción de E1 y/o E3. - Promotor. - Sitio de Poliadenilación.

- Aumeto en la capacidad replicativa. - Menor eficacia de transfección. - Menor respuesta inmune

Empaquetamiento de hasta 14kb

Al deletar E1 empacan 5.1kb y al deletar E1 y E3 8kb

Vectores virales

ADENOVIRUS

Producción de Gutles

-Solo contiene los ITRs, la señal de empaquetamiento, y secuencia de DNA de interés. - Si se utiliza un gen pequeño (menor a 27 Kb), para completar el injerto se utiliza una secuencia de DNA de relleno para linearizar llamada DNA stuffer. - Pueden usarse mutaciones en la señal de empaquetamiento para disminuir partículas competentes. - Se utiliza una variación de células HEK293: 293Cre, que expresan Cre-recombinasa de manera constitutiva. - Se reduce la contaminación de 0.1-10%

Empaquetamiento de hasta 37kb

Vectores virales

Consideraciones

ADENOASOCIADO

1. Se nenecesita de un helper para que se pueda formar la partícula viral, de lo contrario se queda en estado latente.2. NO siempre es otro virus, también pueden helpers fisícos/químicos. 3 Tienen una capacidad de empaquetamiento menor a todos los vectores virales anteriormente mencionados. 4. La selección del AAV a utilizar será en función del tropismo del serotipo. 5. AAV2 es el más utilizado.

Genoma: Molécula simple que contiene DNA de cadena sencilla y además esta flánqueado con ITRs.Genes importantes: rep: Familia de proteínas para la replicación. cap: Familia de proteínas para la estructura viral.

VENTAJAS

- Baja respuesta inmunitaria.- Expresión NO integrativa. - No hay interferencia por promotores. - AAV con tropismo celular.

DESVENTAJAS

Se tiene que la mayor parte de la población (80%) tiene una preinmunidad con algun serotipo de AAV (se puede dar la eliminación del transgen).

EL PROMOTOR DISPUESTO ENTRE EL GEN REP Y CAP ES EL ENCARGADO DE LA REGULACIÓN DEL VIRUS.