DOSSIER Vectores virales y no virales

Terapia genica

Vectores virales

nº

Juan Antonio Reyes de Ochoa

1907032

481

Vectores

Índice de contenidos

Tipos de Vectores

Vectores no virales

Fosfato de calcioMicroinyeccion Biobalistica Microporacion ADN desnudo Encapsulamiento Complejo

Vectores Virales y no virales

Vectores virales

GammaretroviralesLentivirales Espumavirus Adenovirus Adenovirus asociados

Referencias

Presentacion Alumno

Existen tambien diferentes tipos de vectores...

Que es un vector?

Vectores virales: Estos vectores utilizan virus modificados genéticamente para transportar el material genético terapéutico a las células.

En terapia génica, un vector es un vehículo utilizado para introducir material genético específico en las células de un paciente con el propósito de corregir o tratar una enfermedad genética o una afección médica relacionada con la genética. Estos vectores actúan como transportadores de genes terapéuticos o fragmentos de ADN que tienen la capacidad de restaurar una función genética normal o reemplazar una función defectuosa.

Vectores no virales: Estos vectores no involucran virus y, en su lugar, utilizan técnicas químicas o físicas para entregar el material genético a las células.

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Tipos de Vectores No virales

Quimicos

• Fosfatos de calcio

Fisicos

• Microinyeccion
• Biobalistica
• Microporacion
• ADN desnudo

Fosfatos de calcio

• Metodo economico
• Los iones de Ca2 precipitan el ADN

De fusion

• Encapsulamiento
• Complejo

Desventajas

Ventajas

• Sencillo
• Menos toxico

• Poca eficiencia
• Poca expresion genica

Endocitosis

• Inmunoliposoma
• Mediados por receptor
• Dendrimeros

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Fisicos

Desventajas

Ventajas

Microinyeccion

• Es invasiva
• Escalabilidad limitada
• Requiere expertos
• Riesgo a efectos secundarios

• Mayor precision
• Control de la calidad
• Efectiva

Produccion: Se introduce material genetico al nucleo celular mediante un micromanipulador y por la division celular permite la produccion de celulas con el transgen integrado

Biobalistica

Produccion: Se recubren las particulas con material genetico para luego acelarlas y asi intruducirlas medienta descarga electrica o de gas, exponiendo el espacio intracelular y el mismo nucleo unas 20 capas de celulas

Desventajas

Ventajas

• Es costosa
• Perdida de eficiencia
• Produce Muerte celular por los impactor de protectiles

• Tiene versatibilidad celular
• Menos invasiva
• Mayor control de la dosis
• Utilizable in vivo e in vitro

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Microporacion

Produccion

La membrana se permeabiliza transitoriamente mediante pulsos electricos cortos sin dañar las estructuras de la membrana formando poros en los cuales los plasmidos construidos pueden introducirse

Desventajas

Caracteristicas y elementos

Ventajas

• No es invasiva
• Mayor precision y control
• Adecuada para cultivos celulares y tejidos Ex vivo
• Menor riesgo de respuesta inmunitaria

• La eficacia puede varias dependiendo la celula
• Dificultad en aplicaciones clinicas
• Necesidad de equipos especializados
• Muerte celular por diferentes variables

• Permeabiliza la membrana celular para ingresar material genetico
• La supervivencia va depender de la capacidad para sellar los poros abierto

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De fusion

Ventajas

Desventajas

Encapsulamiento y Complejo

• Proteccion del material genetico
• Facilita la administracion
• Pueden ser especificos
• Reduccion de efectos secundarios

Produccion

• La eficiencia puede variar
• complejidad en el diseño
• Respuestas inmunitarias
• Toxicidad moderada

Es mediante la sonicacion de fosfolipidos en agua en el cual varia su tamaño y tipo de vesicula debido a la velocidad de sonicacion. Despues se introduce el material genetico en el centro del liposoma el cual produce algo llamado "lipoplex" l cual lo va proteger de cualquier daño y por su composicion lipidica puede entrar a la celula

Caracteristicas y elementos

• Son vesiculas lipidicas que contienen material genetico
• Se induce la fusion por modificacion de pH
• Es de facil elaboracion y permiten una liberacion controlada

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Endocitosis

Dendrimeros

Es una macromolecula polimerica compuesta de multiples brazos monomericos, estas son contrucciones artificiales

Ventajas

Desventajas

Caracteristicas y elementos

• Complejidad del diseño
• Puede ser costoso
• Eficacia variable
• Puede generar respuestas inmunitarias

• Control de la liberacion
• Pueden tener una elevada capacidad de material genetico
• Biodisponibilidad
• Especificos

• Estructuras de arbol, ramificaciones
• tendencia a adoptar una forma globular
• Puede ser divergente y convergente

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Endocitosis

Inmunoliposoma

Es una variante de liposomas en donde se insertan anticerpos de membrana

Produccion

Se producen de la misma forma que un liposoma normal, por la sonicacion de fosfolipidos en agua variando el tamaño y su vesicula por la velocidad de sonicacion, lo requerido es que se debe de contar con que hay que tener seleccionados los anticuerpos para el tipo de tejido a atacar.

Ventajas

Desventajas

• Direccion especifica
• Entrega eficiente
• Flexibilidad en la carga terapeutica
• Reduccion de la toxicidad

• Complejidad de fabricacion
• Estabilidad limitada

Caracteristicas y elementos

• Se introduce al gen

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Vectores Virales

• Gammaretrovirales

• Lentivirales

• Espumavirus

• Adenovirus

• Adenovirus asociados

Estos vectores se basan en virus modificados para que sean seguros y eficaces en aplicaciones de investigación y terapia génica.

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Gammaretrovirales

Produccion

Ventajas

Desventajas

La producción de un vector viral gammaretrovirus implica la modificación genética del virus para llevar un gen terapéutico. Se siguen estos pasos:

1. Selección y modificación del virus gammaretrovirus.
2. Creación de plásmidos con el gen modificado.
3. Cultivo celular, generalmente en células HEK 293.
4. Transfección de las células con los plásmidos.
5. Producción y recolección de partículas virales.
6. Concentración y purificación.
7. Caracterización y cuantificación.

• Potencial mutagenico
• Transfecta solo en division

• Integracion estable
• Eficiencia en transduccion

Caracteristicas y elementos

• Genes estructurales y regulatorios
• Secuencias de control de la poliproteína gag-pol
• LTRS, region 5U3, region R y 3 U5
• Señal de empaquetamiento

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Variantes de vectores

Con promotor interno

Un vector gammaretroviral con un promotor interno se refiere a un vector viral basado en un gammaretrovirus que ha sido modificado genéticamente para incluir un promotor interno en su genoma. El promotor interno es una secuencia de ADN que controla la expresión de un gen específico en el vector. Esta modificación permite la regulación precisa de la expresión del gen terapéutico o de interés que se encuentra dentro del vector.

Con expresion de dos genes

Un vector gammaretroviral con expresión de dos genes es un tipo de vector viral diseñado para llevar y expresar dos genes diferentes en las células objetivo. Esto permite la entrega simultánea de dos genes terapéuticos, marcadores de selección o cualquier combinación de genes de interés en una aplicación específica.

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Lentivirales

Desventajas

Ventajas

• integracion estable
• Uso en vivo
• Versatilidad

• Potencial mutagenico
• Riesgo de reactivacion viral

La producción de vectores lentivirales implica la generación de vectores basados en lentivirus, como el VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) modificado genéticamente para llevar y expresar genes de interés en células objetivo. Estos vectores son ampliamente utilizados en terapia génica y en investigaciones científicas

Caracteristicas

• Transduccion eficiente
• Baja respueste inmunitaria
• Integracion al genoma
• Exjsten 3 generaciones

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Segunda generacion

Generaciones de vectores lentivirales

Los vectores lentivirales de segunda generación incorporaron mejoras significativas en términos de seguridad al eliminar aún más elementos virales, como la mayoría de las secuencias LTR. El propio vector lleva las secuencia de cis necesarias para la transcripcion, encapsidacion, transcripcion reversa e integracion del genoma viral. En el diseño del sistema, las particulas virales son producidas por la co-transfeccion de tres plasmidos en las celulas productoeas, y los niveles significantes de transcripcion ocurren unicamente en presencia de Tat y Rev

Primera generacion

Los vectores lentivirales de primera generación se basaron en los lentivirus naturales, como el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), y se desarrollaron para la transferencia de genes. Estos vectores incluían componentes esenciales del virus, como las secuencias LTR (regiones largas terminales repetidas) y los genes gag, pol y env, pero se eliminaron genes responsables de la replicación viral, como tat y rev. A pesar de su capacidad para entregar genes a las células huésped, estos vectores presentaban riesgos de seguridad y limitaciones en términos de eficiencia y expresión génica.

Tercera generacion

Los vectores lentivirales de tercera generación continuaron refinando la seguridad y la eficiencia. Se eliminaron casi todas las secuencias virales y se reemplazaron con sistemas de promotor-receptor regulables para controlar mejor la expresión génica.

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Espumavirus

Caracteristicas y elementos

Los vectores de espumavirus, en este contexto, se refieren a vectores de transferencia génica que utilizan el espumavirus como vehículo para entregar genes terapéuticos o de interés a las células. Estos vectores se han desarrollado con la capacidad de transportar material genético a las células huésped y, una vez dentro de la célula, integrar ese material en el genoma del huésped de manera segura y estable.

• Los vectores de espumavirus pueden transducir una amplia variedad de tipos celulares
• Tienen LTRs en sus genomas
• La envoltura viral (proteína de envoltura) se modifica para permitir la entrada en las células diana y para reducir la capacidad de replicación del virus.
• Retrovirus convencionales

Desventajas

Ventajas

• Eficiencia en la transduccion
• Relativamente grandes y complejos

• Baja patogenicidad
• Amplia gama de tipos celulares

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Adenovirus

Caracteristicas

• No se integran en el genoma
• Pueden transportar fragmentos de ADN relativamente grandes
• Estos vectores se usan en vacunas que previenen ciertos tipos de infecciones por virus.

• Cuentan con varias generaciones
• Facilidad con la que se puede manipular el genoma del adenovirus utilizando técnicas de ADN recombinante
• No se asocia con enfermedades graves en individuos inmunocompetentes.
• Se ha utilizado para entregar numerosos genes en modelos preclínicos

Ventajas

Desventajas

• Celulas en reposo o replicacion
• Estable in vivo
• Transduce celulas que no estan en division

• Respuesta inmune
• Manejo dificil
• Direccionabilidad dificil

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Generaciones de los vectores adenovirales

Tercera generacion (Gutles)

Primera generacion

Se eliminan más genes relacionados con la replicación y se introducen más modificaciones para disminuir la inmunogenicidad. Los promotores virales son reemplazados por promotores de células huésped para una regulación más precisa de la expresión génica.

Los vectores adenovirales de primera generación se basan en adenovirus naturales y se han modificado para eliminar genes esenciales para su replicación, como el gen E1A y el gen E1B. Estos genes son cruciales para la replicación viral en células huésped. A pesar de las modificaciones, los vectores de primera generación aún pueden expresar algunas proteínas virales. Esto puede provocar respuestas inmunológicas y limitar su uso en terapia génica.

Segunda generacion

En los vectores de segunda generación, se eliminan aún más genes virales, incluyendo aquellos relacionados con la replicación y la expresión de proteínas virales. Esto disminuye aún más la expresión de proteínas virales y reduce el riesgo de respuestas inmunológicas. los promotores virales se reemplazan por promotores regulables de células huésped. Esto permite un control más preciso de la expresión génica y aumenta la seguridad.

Produccion

• El genoma del VAA recombinante que contiene el transgen, elementos reguladores (promotor y cola de poli A) y los ITRs; a todos estos elementos se les conoce como cassette de expresión y son clonados en un plásmido.
• Los genes rep y cap del VAA silvestre.
• Los genes E2A, E4 y ARN VA del virus colaborador, necesarios para la replicación viral, además de una línea celular que provee la maquinaria básica de biosíntesis. Dentro de las líneas celulares que se utilizan para la producción de los VAA se encuentran las HeLa y las HEK-293 (Human embryonic kidney), las cuales expresan establemente los genes E1A y E1B del Ad.

Ventajas

Desventajas

• Carga limitada
• La expresión génica inducida por vectores AAV puede ser transitoria y disminuir con el tiempo

• Considerados seguros debido a su incapacidad para replicarse
• Baja inmunogenicidad en comparación con otros virus.
• Pueden mantenerse en las células huésped durante largos períodos de tiempo

Adenovirus asociados

Title 1

Alexis Duvergé, Matteo Negroni. Pseudotyping Lentiviral Vectors: When the Clothes Make the Virus.Viruses, MDPI, 2020, 12 (11), pp.1311. �10.3390/v12111311�. �hal-03017702

Smith JG and Eck SL (1999) Molecular characterization of an adenoviral vector resulting from both homologous and nonhomologous recombination. Cancer Gene Ther 6, 475-481

Referencias

Zhang Y, Duan D. Novel Mini-Dystrophin Gene Dual AdenoAssociated Virus Vectors Restore Neuronal Nitric Oxide Synthase Expression at the Sarcolemma. Hum Gene Ther 2011; 22(1): 1-6.

Johnson, R. (2020). Avances recientes en la investigación de vectores virales. Revista de Terapia Génica, 15(3), 212-225.

Schmidt M, Voutetakis A, Afione S, Zheng C, Mandikian D, Chiorini JA. Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity. J Virol 2008; 82(3): 1399-406.

Fausther-Bovendo H and Kobinger GP (2014) Pre-existing immunity against Ad vectors: humoral, cellular, and innate response, what’s important? Hum Vaccin Immunother 10, 2875-2884

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Doctora: Robles Sierra Elda Josefina

Juan Antonio Reyes de Ochoa

Matricula

Terapia Genica, Gpo 481

1907032

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¡gracias!

Terapia genica