VECTORES

vectores virales y no virales

Ana Lorena Hernádez Posada 1991304

Terapia génica

Terapia génica

Sistema de entrega de genes

vectores

La transferencia de genes debe facilitarse mediante métodos físicos (por ejemplo, electroporación o inyección a alta presión), químicos (lípidos o polímeros catiónicos), o herramientas biológicas (vectores virales).

Vehículo utilizado para entregar el material genético a las células con el propósito de corregir una enfermedad genética o modificar su función.

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Prof. Elda Josefina Robles Sierra

Vectores no virales

Endocitsis

Químicos

Inmunoliposomas

Fosfato de calcio

Dendrímero

Fusión

Mejoramiento de vectores no virales

Lisosoma

Virosoma

Biopolimeros

Físicos

Vectores virales

Microinyección

Microproyectiles

Gammaretrovirales

Biobalística

Lentivirus

DNA desnudo

Electroporación

Adenovirus

Sonoporación

Nucleofección

Aenovirus asociados

Magnetofección

Inyección intravascular hidrodinámica

Literatura citada

Vector no viral

os vectores no virales son plásmidos de ADN que pueden administrarse a la células diana

como ADN desnudo o en asociación con diferentes compuestos como liposomas.

Estos vectores deben evitar la degradación por las endonucleasas séricas y evadir la detección inmune. También deben evitar el aclaramiento renal de la sangre y prevenir interacciones inespecíficas (mediante polietilenglicol (PEG) o mediante características específicas de las partículas). Además, estos vectores necesitan extravasarse del torrente sanguíneo para alcanzar los tejidos diana.

Barreras para la administración in vivo exitosa de ácidos nucleicos utilizando vectores no virales.

ste método se basa en gran medida en el hecho de que los cationes metálicos divalentes, como Ca2+, Mg2+, Mn2+ y Ba2+,

Vector químico

pueden formar complejos iónicos con los fosfatos helicoidales del ADN. Luego, los complejos pueden transportarse a través de la membrana celular mediante endocitosis mediada por canales iónicos.

Fosfato de calcio

desVen tajas

Ven tajas

Baja eficiencia

No tóxica

Expresión del gen transitorio

Fácil producción

Bajo costo

Baja especificidad

No hay respuesta inmune

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Vectores de fusión

02

01

Virosoma

Liposoma

Un virosoma es básicamente un liposoma que está cubierto por las glicoproteínas de la envoltura de un virus.Tiene capacidad fusogénica. Podrían inducir respuestas inmunes

Los liposomas son vesículas cerradas formadas por una o más bicapas lipídicas que rodean un compartimento acuoso central.El complejo ADN-lípidos se denomina lipoplex.

03

Biopolimero

Poliplex: Se agrega un agente fusogénico como DOPE para promover la lisis del endosoma.Lipopoliplex: se incorpora al lisosoma por anclaje de polímero a la membrana del lisosoma por entrecruzamiento de lípidos.

El número de moléculas de ADN que llegan efectivamente al núcleo sólo representa una pequeña fracción

• Toxicidad celular mínima
• Median una internalización celular muy eficiente

Métodos físicos

Microproyectiles

Microinyección

Inserción manual de material genético en el núcleo celular utilizando una microaguja fina. Se necesitan células aisladas.

Utilización de partículas pequeñas "Micropartículas" para transporte de material genético a células objetivo.Es mediante fuerza explosiva. Son recubiertos con material inerte (oro, tungsteno) para facilitar la aceleración y penetración celular.

desVen tajas

Ven tajas

Baja eficiencia de transfección

Baja citotoxicidad

desVen tajas

Ven tajas

Díficil

Flexibilidad

In vivo e in vitro

Mucha muerte celular

Alta eficiencia

Mucho tiempo

La eficiencia es varible

No hay respuesta inmune

No hay respuesta inmune

Integración multiple

Limitaciones en escala

Métodos físicos

DNA desnudo

Biobalística

Introducción ADN en las células bombardeándolas con perlas del tamaño de una micra que llevan ADN plasmídico adsorbido en su superficie.Se utiliza una pistola genética que dispara partículas de oro o tungsteno a muy alta velocidad hacia el interior.

IEl ADN desnudo se refiere al ADN que no está asociado con proteínas, lípidos o cualquier otra molécula para ayudar a protegerlo. Es transportado en una solución salina o sérica y es administrado por medio de una inyección intramuscular al tejido. el material es endocitado a través del poro nuclear.

desVen tajas

Ven tajas

desVen tajas

Ven tajas

Baja eficiencia de transfección

Atraviesa facilmente

Muy baja eficiencia de transfección

No se integra al genoma

Rendimiento bajo

Transformación es simple

Expresión transitoria

No hay respuesta inmune

Material genético grande

Alto costo de insumos

Electroporación y Variantes

02

01

Nucleofección

Electroporación

Utiliza una corriente eléctrica pulsada con precisión para crear poros temporales en la membrana celular a través de los cuales pueden pasar las moléculas. El material genético puede permanecer independiente (como un plásmido) o integrarse en el genoma.

Utiliza una combinación de soluciones especializadas y parámetros eléctricos específicos para lograr la entrega directa de ADN plasmídico al núcleo celular, lo que da como resultado una mayor expresión genética.

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desVen tajas

Ven tajas

Ven tajas

Eficiencia de transfección

Transfección rápida

Equipo especializado

Daño celular y mortalidad

Amplia gama de sustratos

Requiere equipo especial

In vivo e in vitro

Transfección baja y transitoria

Fácil de usar

Gran cantidad de células

Variantes de la electroporación

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03

Sonoporación

Magnetofección

Entrega de material genético con partículas magnéticas controladas por un campo magnético externo. el campo magnético promueve la acumulación y retención de partículas magnéticas en el área de su aplicación

Se debe a la capacidad de los ultrasonidos para generar cavitación acústica, que finalmente determina la formación de microporos en la membrana plasmática. Se puede lograr inyectando un plásmido o un oligonucleótido en el variable según las diferentes condiciones experimentales

desVen tajas

Ven tajas

desVen tajas

Ven tajas

Transfección eficiente

Toxicidad

Limitaciones en la transfección

Facilidad de montaje

Difícil de estandarizar

Especificidad

Muy variable

Menor dosis de ácido nucleico

Caracter no invasivo

Variantes de la electroporación

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Inyección intravascular hidrodinámica

Permite que el ADN o el ARN atraviesen las uniones de las células endoteliales, induciendo su separación, y luego determina la formación transitoria de poros o microdefectos en el plasma.El aumento local transitorio de la presión hidrostática aumenta significativamente la internalización celular de los ácidos nucleicos que circulan en la sangre.

Se puede aplizar en diferentes organos in vivo

desVen tajas

Ven tajas

Simple

Baja eficiencia

Vectores de endocitosis

01 Inmunoliposomas

Los inmunoliposomas se generan mediante el acoplamiento de anticuerpos a la superficie liposomal y permiten un direccionamiento activo al tejido mediante la unión a receptores específicos de células tumorales

In vitro e in vivo y parecen ser sistemas eficaces para mejorar el tratamiento del cáncer.

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02 Dendrímeros

Existen dos tipos de construcciones: convergente o divergente. Los dendrímeros se unen al material genético para la entrega de genes. Debido a su tamaño nanométrico, los dendrímeros pueden interactuar específica y eficazmente con membranas y proteínas. Pueden llegar a ser tóxicos

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¿Cómo mejorar los vectores no virales?

Una de las estrategias de las que se tiene conocimiento actual es del tratamiento de células con fotosensibilizadores, también conocido como "internalización fotoquímica" ( Oliveira et al., 2007 ; Zamora et al., 2014 ). Tras su absorción, los fotosensibilizadores provocan una alteración oxidativa de las membranas endosómicas inducida por la luz, lo que da como resultado una mayor entrega de genes ( Selbo et al., 2010 ).Otro método para mejorar el escape endosómico de vectores no virales es la modificación de su superficie con péptidos que penetran las células (CPP). También para la entrada nuclear al DNA se consideró la conjugación covalente de ADN con una señal de localización nuclear peptídica (NLS), ( Ludtke et al., 1999). Por otro lado, la modulación del proceso de internalización celular mediante la variación del diseño de nanopartículas y la orientación del receptor puede acelerar la absorción y aumentar la cantidad de material genético internalizado (Sakaguchi et al., 2008 ; Trusov et al., 2011 ; Ulasov et al., 2011 ; Obispo et al., 2016 ).

Vector viral

l sistema más eficaz para introducir un gen en una célula es explotar las propiedades de

los vectores derivados de los virus que infectan las células animales.

Normalmente, un vector viral se define por tres componentes como sigue: (1) La cápside y/o envoltura proteica que encapsida la carga genética y define el tropismo tisular o celular y el reconocimiento de antígeno del vector. (2) El transgén de interés, que cuando se expresa en células, sirve para conferir un efecto deseado. (3) El “casete regulatorio, ”los elementos potenciadores/promotores/auxiliares combinados que controlan la expresión somática estable o transitoria del transgén como un episoma o como un integrante cromosómico.

rETROVIRUS

Virus con genoma de ARN monocatenario de polaridad positiva

Vectores retrovirales

Existen dos tipos de vectores retrovirales: Deficiente: Remplaza la región codificante por proteinas estructurales. Competente: Contiene lo necesario para la síntesis del virus

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Genoma

Gammaretrovirus

Producción

Tanto las proteínas Gag/Pol como Env, así como la construcción del vector retroviral, se coexpresan de forma transitoria o estable en las denominadas "líneas celulares empaquetadoras" Las proteínas estructurales virales sólo reconocen la construcción del vector retroviral que contiene ψ, lo que conduce a un empaquetado preferencial de los genomas del vector retroviral en partículas infecciosas.

1. Afecta células en división.
2. Usa el virus de la leucina murina

1. Se integra al genoma
2. Tiene una expresión permanente

1. Sólo para ex vivo

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01

Gammaretrovirus

Mejoramiento

Se puede colocar el gen amino 3'-glicosil fosfotransferasa para evitar la degradación

Gammaretrovirales y variantes

Con promotor interno

Expresan dos genes

Vector retroviral canónico en el que la expresión génica terapéutica está impulsada por la LTR viral.

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01

Variantes de gammaretrovirus

Vectores autoinactivantes

Vectores de doble copia

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02

Lentivirus

1. Diseminación de nuevos virus

1. Proporcionar una expresión genética estable y a largo plazo
2. Infecta células que no se dividen

Segunda generación

1. Vector transgen
2. Vectores de empaquetamiento (tat y rev)
3. VSV-G

Genoma silvestre

Tercera generación

1. vector transgen (sin U3 y se agrega un promotor)
2. 3 vectores de empaquetamiento (gag y pol, REV es expresado)
3. VSV-G

Primera generación

1. Vector transgen
2. Vectores de empaquetamiento con promotor fuerte
3. VSV-G

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03

Adenovirus

Virus icosédricos sin envoltura de tamaño mediano (90-100 nm) con ADN bicatenario.

Genoma silvestre

1. Difícil manejo
2. Respuesta inmune e inflamatoria

1. Son estables in vivo
2. Episomales

03

Adenovirus

• Son removidos los cassettes E1 y E3.
• Se hace el uso de un promotor y sitio de poliadenilación.

• Son removidos los cassettes E1, E2, E3 y E4
• Secuencia de interes
• Existe una señal de empaquetamiento

03

Adenovirus

• Contiene los ITRs, señal de empaquetamiento y secuencia ADN combinado con un Helper.
• Se usa un stuffer ADN
• Gen< 27: Se utiliza la secuencia de DNA irrelevante llamada stuffer.

04

Adenovirus asociados

Vector rAAV clásico con las ITR en cada extremo de un casete transgénico (promotor heterólogo, gen de interés, señal intrón/poliA).

El AAV es una capa de proteína que rodea y protege un pequeño genoma de ADN monocatenario de aproximadamente 4,8 kilobases (kb).Su genoma monocatenario contiene tres genes, Rep (Replicación), Cap (Cápside) y aap .(Asamblea). Poseen una corta longitud del trasgen, sin embargo es poco inmunigénico

Literatura científica

1. Bulcha, J.T., Wang, Y., Ma, H. et al. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Sig Transduct Target Ther 6, 53 (2021). https://doi.org/10.1038/s41392-021-00487-6 2. Connolly J. B. (2002). Lentiviruses in gene therapy clinical research. Gene therapy, 9(24), 1730–1734. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3301893 3. Giacca, M. (2010). Methods for Gene Delivery (Capítulo 3, páginas 47-132). En Gene Therapy. Springer Milan. ISBN 9788847016439. URL: https://books.google.com.mx/books?id=YnT70kk9qnkC 4. Herweijer, H; Wolff, J A (2003). Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy. , 10(6), 453–458. doi:10.1038/sj.gt.3301983 5. Jayandharan, Giridhara R. (2018). Gene and Cell Therapy: Biology and Applications || Viral- and Non-viral-Based Hybrid Vectors for Gene Therapy. , 10.1007/978-981-13-0481-1(Chapter 4), 111–130. doi:10.1007/978-981-13-0481-1_4 6. Mak, T. W., Saunders, M. E., & Jett, B. D. (2014). Chapter 14 - Vaccination. In T. W. Mak, M. E. Saunders, & B. D. Jett (Eds.), Primer to the Immune Response (Second Edition) (pp. 333-375). Academic Cell. ISBN 9780123852458. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-385245-8.00014-5 7. Merten, Otto-Wilhelm; Al-Rubeai, Mohamed (2011). [Methods in Molecular Biology] Viral Vectors for Gene Therapy Volume 737 || Introduction to Viral Vectors. , 10.1007/978-1-61779-095-9(Chapter 1), 1–25. doi:10.1007/978-1-61779-095-9_1 8. Rey-Rico, A., & Cucchiarini, M. (2016). Controlled release strategies for rAAV-mediated gene delivery. Acta biomaterialia, 29, 1–10. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2015.10.015 9. Roy, I., Mitra, S., Maitra, A., & Mozumdar, S. (2003). Calcium phosphate nanoparticles as novel non-viral vectors for targeted gene delivery. International journal of pharmaceutics, 250(1), 25–33. https://doi.org/10.1016/s0378-5173(02)00452-0 10. Selbo, P. K., Weyergang, A., Høgset, A., Norum, O.-J., Berstad, M. B., Vikdal, M., et al. (2010). Photochemical internalization provides time- and space-controlled endolysosomal escape of therapeutic molecules. J. Control. Release 148, 2–12. doi: 10.1016/j.jconrel.2010.06.008 11. Yaniz-Galende, E. (2014). Cardiac Regeneration and Repair || Stem cell and gene therapy for cardiac regeneration. , (), 347–379. doi:10.1533/9780857096708.4.347 12. Yin, Hao; Kanasty, Rosemary L.; Eltoukhy, Ahmed A.; Vegas, Arturo J.; Dorkin, J. Robert; Anderson, Daniel G. (2014). Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics, 15(8), 541–555. doi:10.1038/nrg3763 13. Zhang, Xia (2014). Principles of Cloning || Advances in the Generation of Transgenic Domestic Species via Somatic Cell Nuclear Transfer. , (), 95–106. doi:10.1016/B978-0-12-386541-0.00008-4