Terapia Génica AAE

Universidad Autónoma de Nuevo LeónFacultad de Ciencias Biológicas Lic. Biotecnología Genómica Docente: Elda Josefina Robles Sierra

Vectores virales y no virales

Terapia Génica

Abigail Arreaga Escareño Grupo 481 Matrícula: 1924882 San Nicolás de los Garza, Nuevo León a 10 de septiembre de 2023

Índice

Liposomas

Terapia génica

Vectores de fusión

Lipoplex

Microinyección

Polímeros

Biobalística

Dendrímeros

Electroporación

Endocitosis

Vectores No Virales

Inyección intramuscular hidrodinámica

Retrovirus

Sonoporación

Gammaretrovirus

Magnetofección

Vectores virales

Espumavirus

DNA desnudo

Lentivirus

Adenovirus

Tranferencia con fosfato de calcio

Adeno Asociados

Terapia Génica

Permite introducir secuencias (DNA o RNA) dentro de una célula blanco. Es decir es la modificación genética.

Para introducir el gen al genoma es necesario de vectores que lleven la información genética...

Vectores No Virales

Forman un complejo-DNA, lleva el gen de interés con ayuda de moléculas que faciliten la entrada a la célula. Se clasifican en

• Físicos
• Químicos
• Endocitosis
• Fusión

+ info

Vectores Físicos

MICROINYECCIÓN

• Con ayuda de una inyección se coloca el materia genético en núcleo de la célula.
• Se requieren células aisladas
• Se utiliza con frecuencia en estudios ex vivo

Ventajas

• Alta eficacia de transfección
• Alta precisión de entrega del material genético
• Baja necesidad de material genético

• Desventaja
• Eficacia de integración del 30%
• Posible daño a la célula en el proceso

BIOBALÍSTICA

• El plásmido de ADN a transferir es situado sobre la superficie (se utilizan pequeñas gotas de oro o tungsteno)
• Se disparan mediante una descarga eléctrica hacia la célula.

Se utilizan con frecuencia en cultivos de líneas celulares, epidermis, músculo e hígado.

Desventajas

• Se produce muerte celular
• Eficacia variable y transitoria
• Integración efectiva en el genoma 10-8 de las células expuestas

Ventajas

• Efectivo de transferir genes tanto in vitro como in vivo
• Fácil manejo
• Un único disparo puede producir integraciones múltiples

ELECTROPORACIÓN

• Se aplica una corriente eléctrica en células, lo cual es capaz de abrir poros en la membrana celular permitiendo la entrada del gen en su interior
• Se usa in vitro como in vivo

Ventajas

• Las células pueden ser aisladas del organismo y sometidas a un control de calidad
• Amplia aplicabilidad
• Permite la entrega de fragmentos de ADN más grandes

Desventajas

• Muerte de muchas células en el protocolo
• Baja eficacia y transitoria
• Dificultad en tejidos sólidos

VARIACIONES DE MEJORAMIENTO

NUCLEOFECCIÓN

• Los ácidos nucleicos son introducidos en el núcleo de la célula
• Efectiva para transfectar stem cells, neuronas, etc

ELECTROPORACIÓN REVERSIBLE

• Se aplica pulsos eléctricos fuertes y permite la entrada temporal de moléculas a la membrana
• No causa daño irreversible a las células

NANOELECTROPORACIÓN

• Aplicación de pulsos eléctricos en la escala nanométrica
• Administración muy precisa y focalizada de material genético

INYECCIÓN INTRAVASCULAR HIDRODINÁMICA

• Administra ácidos nucleicos a través del torrente sanguíneo a las células y tejidos circundantes
• Forma poros en la membrana
• Utilización in vivo

Ventajas

• Acceso múltiple a tejidos
• No invasiva
• Amplia distribución de genes

Desventajas

• Posible riesgo de trombosis
• Potencial de respuesta inmune

VARIACIONES DE MEJORAMIENTO

Desarrollo de vectores de entrega mejorados

Permite el aumento de capacidad de los genes para llegar a la célula

Nanopartículas

• Permite estabilidad y la eficacia de la entrega
• Liberación controlada

Mejora en la velocidad de inyección

Mejora la distribución y la eficacia de la entrega

SONOPORACIÓN

Ventajas

• Disminuye el riesgo asociado de efectos adversos
• Incorporación de genes altamente eficiente en tejidos mesenquimales

• Con la ayuda de ondas ultrasónicas de baja intensidad se generan microporos en la membrana (incrementa permeabilidad)
• Se usa en paredes vasculares, corazón y músculo
• Administración sistémica

Desventajas

• Baja eficiencia de la transferencia de genes
• Daño de las células diana
• Puede causar apoptosis cuando se aplica al cáncer con genes terapéuticos

VARIACIONES DE MEJORAMIENTO

Las microburbujas colapsan en la fase de alta presión, emitiendo ondas de choque que perturban la membrana celular y aumentan la permeabilidad, por lo que se ha mejorado la sonoporación con el uso de estas:

Microburbujas de contraste

• Al ser agentes de contraste, aumenta la eficacia de la permeabilización de las membranas celulares

Burbujas liposomales

• Mejoran significativamente la eficiencia de transfección de ADN plasmídico
• Útil para la administración in vitro e in vivo

Microburbujas catiónicas

• Es adecuada para la técnica porque los ácidos nucleicos están cargados negativamente

MAGNETOFECCIÓN

Utilización de nanopartículas magnéticas recubiertas de DNA en presencia de un campo magnético. Con fuerza magnética se introduce el DNA

Ventajas

• Mayor eficiencia
• Dirige con precisión el material genético
• No invasiva

Desventajas

• Formulación de nanopartículas magnéticas con ADN desnudo es complejo

VARIACIONES DE MEJORAMIENTO

Magnetopoliplexos

• Presenta características favorables de protección del ADN, unión y captación celular.

Magnetolipoplejos

• Aumenta la transferencia de genes a las células

Puedes escribir un subtítulo

DNA DESNUDO

• Introducción de DNA en una solución salina por inyección intramuscular
• Posible inseción a través del poro nuclear

• Bajo porcentaje de transfección
• Baja tasa de éxito y expresión genética

Desventajas

Ventajas

• No integración al genoma
• Introducción un transgén de hasta ~15 KB

VARIACIONES DE MEJORAMIENTO

Conjugación con péptidos o ligandos

• Permite una dirección más precisa hacia las células
• Aumenta la selectividad

Mejoramiento en la estabilidad del DNA

• Una resistencia contra las enzimas degradantes en el ambiente extracelular permite la llegada antes de la degradación del DNA

VECTORES NO VIRALES QUÍMICOS

TRANSFERENCIA CON FOSFATO DE CALCIO

Ventajas

• No tóxico
• Transfiere fragmentos grandes de DNA

• Los iones calcio precipitan el ADN provocando que la célula (por endocitosis) introduzca el ADN en su interior
• Se utiliza un buffer de fosfato
• Utilizada en cultivos celulares y solo ex vivo

Desventajas

• Expresión génica transitoria
• Eficacia del 10%

VARIACIONES DE MEJORAMIENTO

Formación de complejos de calcio y fosfato + ADN

• La formación de un complejo añadiendo otra solución puede aumentar la precipitación del DNA

• Modificación de pH
• El cambio de pH puede aumentar la eficiencia de transferencia del transgen

VECTORES DE FUSIÓN

LIPOSOMAS

Pequeñas vesículas (estructuras esféricas) hechas de fosfolípidos que pueden utilizarse en la entrega de drogas o DNA

Desventajas

• Limitada estabilidad
• Eficacia de encapsulación baja

Ventajas

• Protección de degradación
• Facilidad de entrada a la célula

LIPOPLEX

Formación por interacciones electrostáticas entre cabezas de los lípidos y las cargas negativas de los ácidos nucleicos

Ventajas

• Elevada eficiencia de transfección

Desventajas

• Tienden a formar agregados de partículas grandes y heterogéneas
• Unión inespecífica a componentes séricos negativos

La carga positiva del grupo de cabeza polar del lípido catiónico se une con interacciones con la carga negativa de la cadena de ADN

LIPOPLEX NEUTRO

LIPOPLEX CATIÓNICO

LIPOPLEX ANIÓNICO

• Compuestos neutros con cargas parciales positivas y negativas
• Sirven para constructos de lipoplex

Ventaja

• Baja toxicidad

Desventaja

• Menor eficiencia de transfección

• Tienen carga positiva en su estructura.

• Interacción con DNA por las cargas

Ventajas

• Baja inmunogenicidad

Desventaja

• Tendencia a formar agregados

• Tienen carga negativa en su estructura.
• Pueden formar complejos con ácido nucleicos a través de interacciones electrostáticas

Ventaja

• Transportador sitio-específico

Desventaja

• Limitada capacidad de entrada

Variaciones de mejoramiento

Para evitar el sistema fagocitario mononuclear, incrementar las transfecciones, entre otros aspectos, se han creado liposomas cómo:

Lípidos policatiónicos (DOSPA)Posee múltiples cargas positivas

Lípidos neutros (DOPE)No poseen átomos cargados

Lípidos catiónicosSu dominio hidrófilo tiene un grupo químico cargado positivamente

Liposomas a base de poliaminoácidos (PAA)Incorporan poliaminoácidos sintetizados gracias a polimerizaciones

Polímeros

Polímeros catiónicos que forman poliplex por atracción de cargas. Usados in vitro. Los más utilizados son

• Poli-etileno-glicol (PEG)
• Poli-L-lisina (PLL)

Poli-etileno-glicol (PEG)

• Estabilizador estérico
• Asociado a un liposoma

Poli-L-lisina (PLL)

• Más eficiente que un lípido catiónico
• Utilizado en sistema hepático

Ventajas

• Biocompatibilidad
• Toxicidad baja

Desventajas

• Eficiencia de transfección limitada

Variaciones de mejoramiento

INMUNOLIPOSOMAS

Se insertan anticuerpos en la membrana del liposoma Ventaja

• Sitio-específico

MEDIADOS POR RECEPTOR

Conjugación de un ligando con un policatión Ventaja

• Introducción existosa del gen

DENDRÍMEROS

• Nanopartícula de biomateriales con estructura de árbol. Interaccionan con sistemas biológicos
• Eficacia de transfección del 50%

Ventajas

• Interacción con múltiples receptores
• Toxicidad baja in vitro e in vivo

Desventaja

• Mayor tamaño molecular mayor toxicidad

VARIACIONES DE MEJORAMIENTO

Modificación de grupos terminales Mejora la interacción con el ácido nucleico

Conjugación de ligandos Mayor selectividad

Modificación de estructura interna Aumentar la capacidad de carga de ácidos nucleicos

ENDOCITOSIS

Introducción de partículas en una céluls, las endocita en vesículas hechas de membrana plasmática.

Pinocitosis

• La célula absorbe sustancias disueltas que se unen a la membrana celular

Fagocitosis

• Las células absorben material sólido grande

Endocitosis mediada por receptores

• Receptores especializados en la superficie celular que internalizan moléculas específicas

VECTORES RETROVIRALES

Retrovirus 3 genes

• Gag
• Pol
• Env

LTR´s Secuencias de empaquetamiento, corte y empalme

Vectores virales

Ventaja

• Integración al genoma

Desventaja

• Mutagénesis

PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES

1. Transfectar células empaquetadoras (ejemplo de fibroblastos) que expresen gag y pol
2. Introducción en las células con vector retroviral + gen de interés
3. Producción de viriones que contienen el genoma del vector

Esto permite una transfección estable del vector

CONTRUCCIÓN DE VECTOR

GAMMARETROVIRUS

Estructura

• LTR´s, región 5'U3 región R y región 3'U5
• PBS (transcripción reversa)
• SD y SA (sitios de splice)
• Señal de empaquetamiento
• PPT (poli-purinas)

Ventajas

• Alta eficacia de transfección
• Integración al genoma

Desventajas

• Capacidad de tamaño
• Uso solo ex vivo

Construcción de vector

Con promotor interno

Expresión de dos genes

PRODUCCIÓN

1. Plásmido que contiene el ADN proviral
2. Tranfección de plásmido en una línea celular de empaquetamiento (origen murino) que expresen genes gag, pol y env
3. El vector tiene la señal de empaquetamiento, reconoce a gag
4. El plásmido que contiene el vector retroviral se transcribe a partir de la LTR 5'
5. Generación de RNAm
6. Transcrpción de forma inversa del genoma por la RT, y ayuda de PBS y PPT

Espumavirus

Pertenecen a la familia Retroviridae y al género Foamyvirus

• Prevalecen en primates no humanos y en otros mamíferos

Ventajas

• Perfil de seguridad deseable
• Amplio tropismo
• Desventaja

• No han sido estudiados a profundidad
• Baja prevalencia

GENOMA DE ESPUMAVIRUS

• Posee los genes gag, pol y env
• Posee LTR´s
• Expresa dos genes accesorios tas y bet

Constructo del vector

LENTIVIRUS

Se basa en el virus HIV-1 Existen 3 generaciones de este virus Ventajas

• Infecta células en no división

Desventajas

• Producción de virus competentes
• Mutagénesis

2da generación

3ra generación

1ra generación

3 plásmidos

• Transgen
• Empaquetamiento con promotor fuerte
• Con VSV-G

Transfección con células HEK293

3 plásmidos

• Transgen
• Empaquetamiento solo con genes tat y rev
• Con VSV-G

4 plásmidos

• Transgen, con deleción de región U3 y uso de promotor
• Empaquetamiento solo con genes gag y pol
• Plámido con rev expresado
• Con VSV-G

PRODUCCIÓN DE LENTIVIRUS

1. Crecimiento y transfección de células empaquetadoras (contienen genes gag, pol y env)
2. Co transfección de plásmidos con el genoma del vector lentiviral
3. Las células empaquetadoras producen las partículas del vector lentiviral

VECTOR ADENOVIRAL

• Genes tempranos (replicación)

E1, E2, E3 y E4

• Genes tardíos (componentes estructurales)

L1, L2, L3, L4 y L5

Infectan a células en división como en no división Ventajas

• No se integra al genoma del huésped

Desventaja

• Respuesta inmune e inflamatoria alta

Vector 2da generación

Vector 1era generación

• Se remueven los genes E2 y E4
• Empaquetan hasta 14kb de DNA

Desventajas

• Menor eficacia de transfección

• Se remueven los genes E1 y/o E3
• Uso de un promotor y sitio poliadenilación
• Introducción de 5.1kb de DNA

Desventajas

• Replicación deficiente
• Fuerte respuesta inmune

PRODUCCIÓN DE VECTOR

1. Vector con secuencia del gen de interés
2. Replicación y empaquetamiento para obtener partículas virales

Método de recombinación en células helper

1. Células HEK293 con DNA de Ad5
2. Transfección con:

Plásmido con deleción de E1 Plásmido con gen de interés + DNA stuffer 3. Se unen fragmentos por recombinación para obtener la secuencia flanqueada por ITRs

Método de recombinación y AMPLIFICACIÓN EN BACTERIA

• 2 plásmidos

-ITR, ori, gen de resistencia, señal de empaquetamiento, deleción E1, sitio de recombinación -Gen terapéutico, gen de resistencia a antibióticos

• Recombinación Cre-loxP

El bacteriófago P1 produce la Cre-recombinasa que reconoce la secuencia de lox-P

PRODUCCIÓN DE GUTLESS

• Solo ITRs, señal de empaquetamiento y secuencia de interés
• Puede utilizarse DNA stuffer
• Uso de células HEK293 que expresan Cre-recombinasa
• Transfectados con un vector adenoviral auxiliar (la región ψ está flanqueada por dos secuencias loxP)
• La recombinasa Cre
• elimina ψ del genoma del virus auxiliar

ADENO ASOCIADOS

Dependen de otro virus para replicación (virus helper)

GEN REP Replicación

• Uso de promotores p5 y p19
• Rep78 y Rep68 (replicación)
• Rep52 y Rep40 (DNA viral)

GEN CAP Cápside

• Promotor p40
• VP1, VP2 cápside
• VP3 mayor para cápside

Ventajas

• No causa respuesta inmune ni inflamatoria

Desventajas

• Se elimina el transgen a las primeras semanas por la pre-inmunidad

Vector AAV

• Deleción de 2 genes
• Contiene ITRs
• Empaquetamiento máximo de 5kb de DNA

PRODUCCIÓN DE VECTOR AAV

• Requiere 2 plásmidos

1. Genes rep y cab sin ITRs + genes de AAV (funcionan como helper)
2. Transgen flanqueado con ITRs

• Transfección con fosfato de calcio

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