Séquençage-ADN_S_Dalaine

Séquençage de l'ADN

Présentation sur les application biotechnologiques en lien avec le séquençage de l'ADN SV-F-1-1 Organisation des génomes

Stéphanie Dalaine

INDEX

vecteur de clonage

Rappels ADN

cas pratique

maxam Gilbert

PCR

quizz

Sanger

Nanopores

méthodes récentes

puce à adn

01

Rappels sur la molécule d'ADN

Représenter schématiquement la structure primaire d'un acide nucléique en l’orientant par ses extrémités 3’ et 5’ (A)

Décrire l’organisation de l’ADN nucléaire eucaryote en estimant la proportion de séquence codante et non codante (A)

rappels sur la molécule d'ADN

Représenter schématiquement la structure tridimensionnelle de l'ADN-B (B)

Exploiter des données de séquençage pour comparer des séquences (A)

A l'issue de l'enseignement de l'UC011, vous devez être capable de:

Expliquer le mode d’action d’une enzyme de restriction (A)

Expliquer la polymérisation d’un acide nucléique (B)

ADN

liaison phosphodiester extrémité 5' et 3' liaisons H désoxyribose adénine

ADN-B

longueur du grand sillon longueur du petit sillon nombre de nucléotides par pas d'hélice diamètre de la double hélice

POlymérisation

sens de polymérisation ADN POlI, POL II, POL III ADN ligase ARN primase helicase protéines SSB topoisomérase

organisation de l'ADN nucléaire eucaryote

séquences uniques, moy vs hautement répétitivesadn informatif éléments génétiques mobiles exons pseudogènes adn centromérique et télomérique

analyser des séquences

ouvrir géniegen2 ouvrir la banque de séquence ouvrir "comprendre le vaccin à ARN" aligner les séquences ARNpréM et ARNM identifier le nb de nucléotides des introns vérifier que le nombre d'aa de la protéine spike est de 1273 acides aminés

enzyme de restriction

Endonucléase reconnaissant une séquence nucléotidique souvent palindromique pls centaines d'enzymes de restriction connues naturellement présentes dans les génomes bactériens (défense contre les bactériophages)

02

séquençage par la méthode de maxam et gilbert

Vidéo

Maxam et Gilbert (70’s): ADN simple brin marqué au 32P, Destruction de bases A+G; G, C + T, C, électrophorèse, révélation par autoradiographie

03

séquençage par la méthode de sanger

04

MÉTHODES RÉCENTES

Polymérisation sur une cellule de flux Illumina Un seul nucléotide marqué est incorporé à chaque cycle, suivi par une étape d’imagerie afin de déterminer quel nucléotide a été incorporé dans chaque cluster (Figure 2C).

05

les vecteurs de clonage

Les vecteurs de clonage

On appelle vecteur l'ADN dans lequel on insère le fragment d'ADN à étudier. L'ADN inséré est appelé insert ou ADN étranger ou ADN exogène. Cette séquence nucléotidique est capable de s'auto-répliquer. Les vecteurs sont donc des petits ADN dans lesquels on insère un fragment d'ADN que l'on veut étudier. Ces petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages. Il est nécessaire d'introduire ces bactériophages ou plasmides dans les bactéries pour réaliser une multiplication de ceux-ci.

Les vecteurs de clonage = Molécule d'ADN permettant d'intégrer un fragment d'ADN hôte à multiplierLes vecteurs de clonage = Molécule d'ADN permettant d'intégrer un fragment d'ADN hôte à multiplier

les plasmides

les phages

Autres types de vecteurs: PaC, YAC

les BAC bactériens

Vidéo

Les plasmides bactériens; des chromosomes circulaires, outils de biotechnologies

Passe ton BAC PAC YAC d'abord!

Les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) Peuvent cloner des fragments d'ADN de taille variant de 100 à 200kb. Les PAC (P1-derived Artificial Chromosome) Peuvent cloner des fragments d'ADN de taille variant de 100 à 200kb. Les YAC (Yeast Artificial Chromosome : Chromosome artificiel de levure). Peuvent intégrer des fragments de grande taille (jusqu'à 400kb). Indispensables pour analyser les grands génomes (notamment, le génome humain).

06

l'amplification par PCR

Etapes de la PCR

Thermocycleur

ADN, primers, Mg2+, dNTP, Taqpolymérase

Connexion possible à un ordinateur pour PCR en RT

programmation du nb de cycles

Observation des produits de la PCR

possibilité de réaliser une électrophorèse des fragments d'ADN puis révélation sous UV

08

séquençage par nanopore

L’ADN à séquencer est capté par une enzyme (hélicase ou ADN polymérase, en bleu) qui extrude l’ADN simple brin à une vitesse réduite. Le nanopore lui-même (en rouge) constitue une ouverture dans la membrane lipidique (en vert) dans laquelle le champ électrique (flèches bleues) force le passage de l’ADN simple brin (en marron). Ce dernier est ralenti au passage par la constriction du nanopore (encart du bas) et permet l’identification des bases individuelles par mesure de l’intensité du courant électrique traversant le pore à un instant donné (encart du haut). Le trait pointillé bleu représente le courant à vide du nanopore.

09

puce à adn

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