Soutenance de stage M1 MFA - LE VERN Amaury

Caractérisation d’une nouvelle espèce bactérienne appartenant au genre Phreatobacter

Amaury LE VERN

IUEM BEEP UMR 6197 Stage M1 encadré par Dr Sophie MIESZKIN

Janvier à Février 2023

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Carbfix 1

Figure 1 - Principe du puits géologique de stockage de carbone - [Carbfix hf.]

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Carbfix 1

HK31

Projet à grande échelle : S4CE

Métabarcoding ARNr 16SMétagénomique (Culture)

Minéraux riches en Hydroxyde de Fer

CoCulture de HK31-P et HK31-G en milieu Ferro-oxydant

Figure 2 - Coupe géologique transversale SudOuest - NordEst au site d'injection de Carbfix 1 [Matter et al., 2011]

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Phreatobacter sp.

Phylogénie

Classe : Alphaproteobacteria Ordre : Hyphomicrobiales Famille : Phreatobacteraceae Genre : Phreatobacter Espèces : P. oligotrophus (2014) P. stygius (2017) P. cathodiphilus (2018)

Figure 3 - Arbre phylogénétique du gène de l'ARNr 16S ( Neighbour-Joining J-C)montrant la position de la souche HK31-P et des espèces les plus proches [K. Jacquot, 2022]

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Gamme de salinité

Galeries API20E et API20NE

Photographies MET

Gamme de température

Bilan

Assimilation de l'Arabinose, présence d'une nitrate réductase et d'une béta-glucosidase

- Photographies d'un flagelle non attaché à la cellule - Calcul de la taille impossible

0 à 0,5% NaCl (optimum 0% NaCl)

15 à 35°C (optimum 35°C)

Objectifs

Caractérisation morphologique de la souche HK31-P

Caractérisation physiologique de HK31-P et des souches reconnues du genre Phreatobacter

Séquençage du génome de la souche HK31-P

Obtenir la taille moyenne des cellules

- Assimilation de substrats carbonés - Détection des enzymes - Croissance en milieu Ferro-oxydant

Acccès aux paramètres génomiques et au potentiel métabolique

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Validation de la pureté des souches par séquençage Sanger

Figure 4 - Profil thermique de PCR suivi - [Biorender]

Bac8F (forward) U1492R (reverse)

Amorces

Intégralité du gène de l'ARNr 16S (~1 500 pb)

Amplification

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Electrophorèse

T-

T- = Témoin négatif de PCR1 et 16 = Marqueur de taille 1 kpb 2 et 3 = P. oligotrophus boîte et liquide 4 et 5 = P. stygius boîte et liquide 6 et 7 = HK31-P boîte 8 et 9 = HK31-P liquide 10 et 11 = HK31-P liquide R2A filtré 12 et 13 = HK31-P liquide 2 14 et 15 = HK31-P liquide 3

Fragment de 1 500 pb

Figure 5 - Gel d'électrophorèse après migration des échantillons 45 min à 90 V dans un gel d'agarose à 1%

Obtention d'amplicons de taille attendue pour chaque souche testée

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Blast taxonomique 16S

Tableau 1 - Blast taxonomique 16S via EzBiocloud de contigs réalisés via le logiciel Geneious

Souches attendues, pures Contigs d'environ 1 500 pb (longueur estimée du gène de l'ARN 16S) Valeur seuil de similarité de 98,7%

UBOCC - UBO Culture Collection

Mise en collection des souches

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Etats frais et colorations de Gram

Culture difficile pour HK31-P- Faible croissance - Fin de phase exponentielle tardive

Milieu Reasonners 2A (R2A) - Adapté à la culture des bactéries se développant dans l'eau potable

Tableau 2 - Etats frais et colorations de Gram

P. oligotrophus

P. stygius

HK31-P

P. cathodiphilus

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Microscopie Electronique à Transmission

Taille moyenne :

0,55 ± 0,16 µm

2,46 ± 0,75 µm

57 photographiesn = 32

Granules de stockage

Figures 6A et 6B - Photographies en MET de cellules de HK31-P sur grilles Fromvar carbone, contre-coloration à l'acétate d'uranyle

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Assimilation des substrats carbonés

Milieu minimum R2A

K2HO4P (0,3 g.L-1) MgSO4 7H2O (0,05 g.L-1)

Substrats testés

L - AlanineArabinose L - Proline Propionate Butyrate Acide lactique Glycogène D - Glucose

20 mM final

Suivi de la croissance

Souches testées

Comptages en cellules de Thoma sur 11 et 7 jours

HK31-P et P. cathodiphilus

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Assimilation des substrats carbonés - HK31-P

Aucun des substrats testés ne semble être assimilés par la souche HK31-P

Figure 7 - Log base 10 du nombre de cellules de HK31-P par millilitre en fonction du temps en jours dans les différents milieux minimums R2A supplémentés à 20 mM d'une source de carbone

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Assimilation des substrats carbonés - P. cathodiphilus

Substrat assimilé par P. cathodiphilus dans la publication de sa description

Substrat non assimilé par P. cathodiphilus dans la publication de sa description

Contrairement aux résultats retrouvés dans la littérature, seul le glycogène a été assimilé par P. cathodiphilus et non l'acide lactique, le propionate et le butyrate

Figure 8 - Log base 10 du nombre de cellules de P. cathodiphilus par millilitre en fonction du temps en jours dans les différents milieux minimums R2A supplémentés à 20 mM d'une source de carbone

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Détection des enzymes - Galeries APIzim API20E et API20NE

Phosphatase alcaline Estérase (C4) Estérase lipase (C8) Leucine arylamidase Phosphatase acide

Trypsine Bêta-glucosidase (ESC) Nitrate réductase (NO3)

P. oligotrophus, P. stygius, P.cathodiphilus

P. stygius, P.cathodiphilus, HK31-P

P. oligotrophus, P.cathodiphilus, HK31-P

Naphtol-AB-BI-phosphohydrolase

HK31-P P. oligotrophus P. stygius P. cathodiphilus

Souches testées possédant ces activités enzymatiques

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Mise en évidence du métabolisme ferro-oxydant

HK31-P

P. oligotrophus

P. stygius

Figure 10 - Milieu liquide FerOx utilisé pour tester le métabolisme ferro-oxydant de HK31-P et des souches du genre Phreatobacter

Expérience préliminaire sur le métabolisme de la ferro-oxydation

Enrichissement initial de la souche HK31-P en coculture avec la Phénylobacter HK31-G

Phase gazeuse (5% O2)

Co-culture HK31-P + HK31-G

Phase semi-solide

Culot Fe/S

Figure 9 - Milieu FerOx utilisé lors de l'enrichissement des souches HK31-P et HK31-G

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Métabolisme de la Ferro-oxidation

Très bonne croissance pour P. stygius, bonne croissance pour P. oligotrophus, pas de croissance pour la souche HK31-P

P. stygius

HK31-P

P. oligotrophus

Figure 11A 11B et 11C - Photographies au microscope optique en grossisement x 1000 des cultures en milieu FerOx (t = 11 jours)

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Obtention du génome de la souche HK31-P

Extraction au Phénol-Chloroforme (PCI)

Inplen

Qubit picogreen

Concentration : 445,05 ng.µl-1

Concentration : 87 ng.µl-1

Pas de contamination protéique (DO 260nm/280nm) Pas de contamination en composés organiques (DO 260nm/230nm)

1,8 < 1,918 < 2,1 2,0 < 2,262 10 ng.µl-1 < 87 ng.µl-1

DO 260nm/280nm

DO 260nm/230nm

Concentration

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Analyses bio-informatiques

Séquençage Illumina SBS (sequencing by synthesis) Reads forward et reverse reçus Analyses effectuées sur Galaxy de l'Ifremer (DATARMOR) Contrôle qualité : FastQC Nettoyage des reads : Trimmomatic après assemblage par Shovill Assemblages : Shovill/Spades - Shovill/Skesa - Shovill/Megahit - Spades Comparaison des assemblages : QUAST

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Comparaison des assemblages pour le génome de HK31-P

Tableau 3 - Comparaison des différents assembleurs via l'outil QUAST

Shovill/Spades

GC% :

Bon assemblage :

Assemblage sélectionné :

• P. oligotrophus = 68,5%
• P. stygius = 66,7%
• P. cathodiphilus = 69,3%

• Peu de contigs
• N50 élevé donc L50 faible

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Arbre phylogénétique du gène de l'ARNr 16S de HK31-P

Souche HK31-P

Espèce type du genre

Des résultats similaires à ceux obtenus par K. Jacquot en 2022

Figure 12 - Arbre phylogénétique du gène de l'ARNr 16S de la souche HK31-P obtenu via TYGS ( Type Strain Genome Server)

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Arbre phylogénomique de la souche HK31-P

Souche HK31-P

Espèce type du genre

La souche HK31-P semble finalement être plus proche de Phreatobacter cathodiphilus

Figure 13 - Arbre phylogénomique de la souche HK31-P obtenu via TYGS

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Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Après ce stage

Gamme de pH

Cinétique de croissance

Chimiotaxonomie

Validation du métabolisme ferro-oxydant

Suivi de croissance par comptages des cellules marquées à l'acridine orange

Calcul des OGRI (Overall Genome Relatedness Index)

ANI et DDN pour s'assurer du statut de nouvelle espèce

Obtention du taux de croissance et du temps de génération

Electroactivité ?

P. cathodiphilus potentiellement électroactive, qu'en est-il de la souche HK31-P ?

Bornes et optimum

Quinones, Acides gras, Lipides polaires

Mise en évidence des voies métaboliques

Lors de ce stage

Photographies MET

Taille moyenne des cellules (2,46 µm par 0,55 µm)

Assimilation de substrats carbonés

Aucun substrat testé n'est assimilé par la souche HK31-P. pour P. cathodiphllus, le glycogène est assimilé

Détection des enzymes pour la souche HK31-P et trois espèces décrites du genre Phreatobacter

La souche HK31-P possède les enzymes suivantes : Phosphatase alcaline, estérase C4, estérase lipase C8, leucine arylamidase, phosphatase acide et naphtol-AS-BI-phosphohdrolase

Extraction de l'ADNg et séquençage du génome de la souche HK31-P

Obtention des paramètres génomiques de la souche HK31-P : GC% = 67,66%, génome de 4 340 490 pb

Avant ce stage

Gamme de température et de salinité

15°C à 35°C (optimum 35°C)0%NaCl à 0,5%NaCl (optimum 0%NaCl)

API 20E et API 20NE

Assimilation de l'Arabinose et réduction des nitrates en nitrites, présence d'une nitrate réductase

Photographies MET

Flagelle non attaché

Gram, Catalase, Oxydase

Gram négatif / Catalase et Oxydase négatifs

Séquençage 16S

Arbre phylogénétique 16S

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Bibliographie

• Sanders B. Genome Assembly of MRSA using Illumina MiSeq Data. Galaxy Training Network. text. Galaxy Training Network. https://training.galaxyproject.org/training-material/topics/assembly/tutorials/mrsa-illumina/tutorial.html. Retrieved 3 June 2023.
• Tóth EM, Vengring A, Homonnay ZG, Kéki Z, Spröer C, Borsodi AK, Márialigeti K, Schumann P. 2014. Phreatobacter oligotrophus gen. nov., sp. nov., an alphaproteobacterium isolated from ultrapure water of the water purification system of a power plant. Int J Syst Evol Microbiol 64:839–845.
• Kim S-J, Ahn J-H, Heo J, Cho H, Weon H-Y, Hong S-B, Kim J-S, Kwon S-W. 2018. Phreatobacter cathodiphilus sp. nov., isolated from a cathode of a microbial fuel cell. Int J Syst Evol Microbiol 68:2855–2859.
• Lee SD, Joung Y, Cho J-C. 2017. Phreatobacter stygius sp. nov., isolated from pieces of wood in a lava cave and emended description of the genus Phreatobacter. Int J Syst Evol Microbiol 67:3296–3300.

• Matter J, Broecker WS, Gislason S, Gunnlaugsson E, Oelkers E, Stute M, Sigurdardottir H, Stefansson A, Alfredsson H, Aradottir E, Axelsson G, Sigfusson B. 2011. The CarbFix Pilot Project - Storing Carbon Dioxide in Basalt. Energy Procedia 4:5579–5585.
• Hedrich S, Schlömann M, Johnson D. 2011. The iron-oxidizing Proteobacteria. Microbiology (Reading, England) 157:1551–64.

• Meier-Kolthoff JP, Göker M. 2019. TYGS is an automated high-throughput platform for state-of-the-art genome-based taxonomy. 1. Nat Commun 10:2182.

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Merci

Avez vous des questions ?

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Composition du milieu Reasonners 2A (R2A)

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Plant-e © - Principe de fonctionnement d'une cellule microbienne de production d'électricité en collaboration avec des plantes

En moins de deux ans, le projet Carbfix 1 aurait permis de fixer, sous forme de calcite, 95% de 250 tonnes de CO2 injecté à l’aide de 25 tonnes d’eau par tonne de CO2.

Principe simplifié de l'extraction d'ADNg au phénol chloroforme (PCI) - [BioRender]

Contrôle qualité - FastQC

Après

Avant

Graphiques des scores de qualité, avant et après trimmomatic par l’outil Shovill sur les reads forward du séquençage de la souche HK31-P

Qualité moyenne représentée par une ligne bleue

Contrôle qualité - FastQC

Oxidation du fer

les bactéries oxydantes de fer acidophiles, aérobiesles bactéries oxydantes de fer aérobies neutrophiles les bactéries oxydantes de fer neutrophiles, anaérobies (dépendants du nitrate) Les bactéries oxydantes de fer photosynthétiques anaérobies.

2Fe2+ + NO3- + 5H2O → 2Fe(OH)3 + NO2- + 4H+

HCO3-+ 4Fe(II) + 10H2O → [CH2O] + 4Fe(OH)3 + 7H+

[Hedrich et al., 2011]