Soutenance de stage M1 MFA - LE VERN Amaury

Janvier à Février 2023

IUEM BEEP UMR 6197 Stage M1 encadré par Dr Sophie MIESZKIN

Amaury LE VERN

Caractérisation d’une nouvelle espèce bactérienne appartenant au genre Phreatobacter

Figure 1 - Principe du puits géologique de stockage de carbone - [Carbfix hf.]

Carbfix 1

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Métabarcoding ARNr 16SMétagénomique(Culture)

Minéraux riches en Hydroxyde de Fer

Carbfix 1

CoCulture de HK31-P et HK31-G en milieu Ferro-oxydant

Projet à grande échelle : S4CE

Figure 2 - Coupe géologique transversale SudOuest - NordEst au site d'injection de Carbfix 1 [Matter et al., 2011]

HK31

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Classe : AlphaproteobacteriaOrdre : HyphomicrobialesFamille : PhreatobacteraceaeGenre : PhreatobacterEspèces : P. oligotrophus (2014)P. stygius (2017)P. cathodiphilus (2018)

Phylogénie

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Phreatobacter sp.

Figure 3 - Arbre phylogénétique du gène de l'ARNr 16S ( Neighbour-Joining J-C)montrant la position de la souche HK31-P et des espèces les plus proches [K. Jacquot, 2022]

Acccès aux paramètres génomiques et au potentiel métabolique

- Assimilation de substrats carbonés- Détection des enzymes- Croissance en milieu Ferro-oxydant

Obtenir la taille moyenne des cellules

Séquençage du génome de la souche HK31-P

Caractérisation physiologique de HK31-P et des souches reconnues du genre Phreatobacter

Caractérisation morphologique de la souche HK31-P

Objectifs

Assimilation de l'Arabinose, présence d'une nitrate réductase et d'une béta-glucosidase

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

- Photographies d'un flagelle non attaché à la cellule- Calcul de la taille impossible

0 à 0,5% NaCl(optimum 0% NaCl)

15 à 35°C (optimum 35°C)

Photographies MET

Galeries API20E et API20NE

Gamme de salinité

Gamme de température

Bilan

Figure 4 - Profil thermique de PCR suivi - [Biorender]

Amplification

Intégralité du gène de l'ARNr 16S (~1 500 pb)

Amorces

Bac8F (forward)U1492R (reverse)

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Validation de la pureté des souches par séquençage Sanger

Obtention d'amplicons de taille attendue pour chaque souche testée

Figure 5 - Gel d'électrophorèse après migration des échantillons 45 min à 90 V dans un gel d'agarose à 1%

Fragment de 1 500 pb

T- = Témoin négatif de PCR1 et 16 = Marqueur de taille 1 kpb 2 et 3 = P. oligotrophus boîte et liquide 4 et 5 = P. stygius boîte et liquide 6 et 7 = HK31-P boîte 8 et 9 = HK31-P liquide 10 et 11 = HK31-P liquide R2A filtré 12 et 13 = HK31-P liquide 2 14 et 15 = HK31-P liquide 3

T-

Electrophorèse

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Souches attendues, puresContigs d'environ 1 500 pb (longueur estimée du gène de l'ARN 16S)Valeur seuil de similarité de 98,7%

Mise en collection des souches

UBOCC - UBO Culture Collection

Blast taxonomique 16S

Tableau 1 - Blast taxonomique 16S via EzBiocloud de contigs réalisés via le logiciel Geneious

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Milieu Reasonners 2A (R2A)- Adapté à la culture des bactéries se développant dans l'eau potable

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Etats frais et colorations de Gram

Culture difficile pour HK31-P- Faible croissance- Fin de phase exponentielle tardive

Tableau 2 - Etats frais et colorations de Gram

P. cathodiphilus

P. stygius

P. oligotrophus

HK31-P

10

Granules de stockage

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

57 photographiesn = 32

2,46 ± 0,75 µm

0,55 ± 0,16 µm

Taille moyenne :

Figures 6A et 6B - Photographies en MET de cellules de HK31-P sur grilles Fromvar carbone, contre-coloration à l'acétate d'uranyle

Microscopie Electronique à Transmission

11

20 mM final

Comptages en cellules de Thoma sur 11 et 7 jours

Suivi de la croissance

HK31-P et P. cathodiphilus

Souches testées

L - AlanineArabinoseL - ProlinePropionateButyrateAcide lactiqueGlycogèneD - Glucose

Substrats testés

K2HO4P (0,3 g.L-1)MgSO4 7H2O (0,05 g.L-1)

Milieu minimum R2A

Assimilation des substrats carbonés

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

12

Figure 7 - Log base 10 du nombre de cellules de HK31-P par millilitre en fonction du temps en jours dans les différents milieux minimums R2A supplémentés à 20 mM d'une source de carbone

Aucun des substrats testés ne semble être assimilés par la souche HK31-P

Assimilation des substrats carbonés - HK31-P

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

13

Figure 8 - Log base 10 du nombre de cellules de P. cathodiphilus par millilitre en fonction du temps en jours dans les différents milieux minimums R2A supplémentés à 20 mM d'une source de carbone

Contrairement aux résultats retrouvés dans la littérature, seul le glycogène a été assimilé par P. cathodiphilus et non l'acide lactique, le propionate et le butyrate

Substrat non assimilé par P. cathodiphilus dans la publication de sa description

Substrat assimilé par P. cathodiphilus dans la publication de sa description

Assimilation des substrats carbonés - P. cathodiphilus

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

P. oligotrophus, P.cathodiphilus, HK31-P

P. stygius, P.cathodiphilus, HK31-P

Souches testées possédant ces activités enzymatiques

TrypsineBêta-glucosidase (ESC)Nitrate réductase (NO3)

P. oligotrophus, P. stygius, P.cathodiphilus

Naphtol-AB-BI-phosphohydrolase

14

HK31-PP. oligotrophusP. stygiusP. cathodiphilus

Phosphatase alcalineEstérase (C4)Estérase lipase (C8)Leucine arylamidasePhosphatase acide

Détection des enzymes - Galeries APIzim API20E et API20NE

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Expérience préliminaire sur le métabolisme de la ferro-oxydation

Figure 10 - Milieu liquide FerOx utilisé pour tester le métabolisme ferro-oxydant de HK31-P et des souches du genre Phreatobacter

P. stygius

P. oligotrophus

HK31-P

Enrichissement initial de la souche HK31-P en coculture avec la Phénylobacter HK31-G

15

Figure 9 - Milieu FerOx utilisé lors de l'enrichissement des souches HK31-P et HK31-G

Co-culture HK31-P + HK31-G

Culot Fe/S

Phase semi-solide

Phase gazeuse (5% O2)

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Mise en évidence du métabolisme ferro-oxydant

16

Très bonne croissance pour P. stygius, bonne croissance pour P. oligotrophus, pas de croissance pour la souche HK31-P

Figure 11A 11B et 11C - Photographies au microscope optique en grossisementx 1000 des cultures en milieu FerOx (t = 11 jours)

HK31-P

P. stygius

P. oligotrophus

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Métabolisme de la Ferro-oxidation

Concentration

DO 260nm/230nm

DO 260nm/280nm

1,8 < 1,918 < 2,12,0 < 2,26210 ng.µl-1 < 87 ng.µl-1

Qubit picogreen

Concentration : 87 ng.µl-1

Concentration : 445,05 ng.µl-1

Inplen

Extraction au Phénol-Chloroforme (PCI)

Pas de contamination protéique (DO 260nm/280nm)Pas de contamination en composés organiques (DO 260nm/230nm)

17

Obtention du génome de la souche HK31-P

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

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Séquençage Illumina SBS (sequencing by synthesis)Reads forward et reverse reçusAnalyses effectuées sur Galaxy de l'Ifremer (DATARMOR)Contrôle qualité : FastQC Nettoyage des reads : Trimmomatic après assemblage par ShovillAssemblages : Shovill/Spades - Shovill/Skesa - Shovill/Megahit - Spades Comparaison des assemblages : QUAST

Analyses bio-informatiques

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Shovill/Spades

• P. oligotrophus = 68,5%
• P. stygius = 66,7%
• P. cathodiphilus = 69,3%

GC% :

19

Tableau 3 - Comparaison des différents assembleurs via l'outil QUAST

Assemblage sélectionné :

• Peu de contigs
• N50 élevé donc L50 faible

Bon assemblage :

Comparaison des assemblages pour le génome de HK31-P

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Des résultats similaires à ceux obtenus par K. Jacquot en 2022

20

Figure 12 - Arbre phylogénétique du gène de l'ARNr 16S de la souche HK31-P obtenu via TYGS ( Type Strain Genome Server)

Espèce type du genre

Souche HK31-P

Arbre phylogénétique du gène de l'ARNr 16S de HK31-P

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

La souche HK31-P semble finalement être plus proche de Phreatobacter cathodiphilus

21

Figure 13 - Arbre phylogénomique de la souche HK31-P obtenu via TYGS

Espèce type du genre

Souche HK31-P

Arbre phylogénomique de la souche HK31-P

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

Mise en évidence des voies métaboliques

Quinones, Acides gras, Lipides polaires

Bornes et optimum

P. cathodiphilus potentiellement électroactive, qu'en est-il de la souche HK31-P ?

Electroactivité ?

Obtention du taux de croissance et du temps de génération

ANI et DDN pour s'assurer du statut de nouvelle espèce

Calcul des OGRI (Overall Genome Relatedness Index)

Suivi de croissance par comptages des cellules marquées à l'acridine orange

Validation du métabolisme ferro-oxydant

Chimiotaxonomie

Cinétique de croissance

Gamme de pH

Après ce stage

22

Obtention des paramètres génomiques de la souche HK31-P : GC% = 67,66%, génome de 4 340 490 pb

Extraction de l'ADNg et séquençage du génome de la souche HK31-P

La souche HK31-P possède les enzymes suivantes : Phosphatase alcaline, estérase C4, estérase lipase C8, leucine arylamidase, phosphatase acide et naphtol-AS-BI-phosphohdrolase

Détection des enzymes pour la souche HK31-P et trois espèces décrites du genre Phreatobacter

Aucun substrat testé n'est assimilé par la souche HK31-P. pour P. cathodiphllus, le glycogène est assimilé

Assimilation de substrats carbonés

Taille moyenne des cellules (2,46 µm par 0,55 µm)

Photographies MET

Arbre phylogénétique 16S

Séquençage 16S

Gram négatif / Catalase et Oxydase négatifs

Gram, Catalase, Oxydase

Flagelle non attaché

Photographies MET

Assimilation de l'Arabinose et réduction des nitrates en nitrites, présence d'une nitrate réductase

API 20E et API 20NE

15°C à 35°C (optimum 35°C)0%NaCl à 0,5%NaCl (optimum 0%NaCl)

Gamme de température et de salinité

Lors de ce stage

Avant ce stage

Introduction - Souches - Morphologie - Physiologie - Génomique - Conclusions et perspectives

• Sanders B. Genome Assembly of MRSA using Illumina MiSeq Data. Galaxy Training Network. text. Galaxy Training Network. https://training.galaxyproject.org/training-material/topics/assembly/tutorials/mrsa-illumina/tutorial.html. Retrieved 3 June 2023.
• Tóth EM, Vengring A, Homonnay ZG, Kéki Z, Spröer C, Borsodi AK, Márialigeti K, Schumann P. 2014. Phreatobacter oligotrophus gen. nov., sp. nov., an alphaproteobacterium isolated from ultrapure water of the water purification system of a power plant. Int J Syst Evol Microbiol 64:839–845.
• Kim S-J, Ahn J-H, Heo J, Cho H, Weon H-Y, Hong S-B, Kim J-S, Kwon S-W. 2018. Phreatobacter cathodiphilus sp. nov., isolated from a cathode of a microbial fuel cell. Int J Syst Evol Microbiol 68:2855–2859.
• Lee SD, Joung Y, Cho J-C. 2017. Phreatobacter stygius sp. nov., isolated from pieces of wood in a lava cave and emended description of the genus Phreatobacter. Int J Syst Evol Microbiol 67:3296–3300.

• Matter J, Broecker WS, Gislason S, Gunnlaugsson E, Oelkers E, Stute M, Sigurdardottir H, Stefansson A, Alfredsson H, Aradottir E, Axelsson G, Sigfusson B. 2011. The CarbFix Pilot Project - Storing Carbon Dioxide in Basalt. Energy Procedia 4:5579–5585.
• Hedrich S, Schlömann M, Johnson D. 2011. The iron-oxidizing Proteobacteria. Microbiology (Reading, England) 157:1551–64.

• Meier-Kolthoff JP, Göker M. 2019. TYGS is an automated high-throughput platform for state-of-the-art genome-based taxonomy. 1. Nat Commun 10:2182.

Bibliographie

22

Merci

Avez vous des questions ?

23

Composition du milieu Reasonners 2A (R2A)

23

Plant-e © - Principe de fonctionnement d'une cellule microbienne de production d'électricité en collaboration avec des plantes

En moins de deux ans, le projet Carbfix 1 aurait permis de fixer, sous forme de calcite, 95% de 250 tonnes de CO2 injecté à l’aide de 25 tonnes d’eau par tonne de CO2.

Principe simplifié de l'extraction d'ADNg au phénol chloroforme (PCI) - [BioRender]

Qualité moyenne représentée par une ligne bleue

Graphiques des scores de qualité, avant et après trimmomatic par l’outil Shovill sur les reads forward du séquençage de la souche HK31-P

Après

Avant

Contrôle qualité - FastQC

Contrôle qualité - FastQC

[Hedrich et al., 2011]

les bactéries oxydantes de fer acidophiles, aérobiesles bactéries oxydantes de fer aérobies neutrophilesles bactéries oxydantes de fer neutrophiles, anaérobies (dépendants du nitrate)Les bactéries oxydantes de fer photosynthétiques anaérobies.

HCO3-+ 4Fe(II) + 10H2O → [CH2O] + 4Fe(OH)3 + 7H+

2Fe2+ + NO3- + 5H2O → 2Fe(OH)3 + NO2- + 4H+

Oxidation du fer