L'ingegneria genetica e le Biotecnologie

L'INGEGNERIA GENETICA E LEBIOTECNOLOGIE

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Indice

La storia delle biotecnologie

L'avvento delle biotecnologie moderne

Le tecniche dell'ingegneria genetica

Tagliare il DNA

L'elettroforesi su gel

Ricucire il DNA

I vettori plasmidici

Il clonaggio

La reazione a catena della polimerasi

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La storia delle biotecnologie

Le biotecnologie tradizionali si basano sull'utilizzo di organismi selezionati per le loro caratteristiche desiderabili, come nel caso della coltivazione del frumento e nella produzione di bevande fermentate come birra, vino e pane. Queste pratiche hanno radici antiche e si sono diffuse in diverse culture nel corso dei millenni. Tuttavia, con l'avvento delle biotecnologie moderne, è stata introdotta una nuova fase nel campo. Le biotecnologie moderne si basano sull'utilizzo di parti di organismi o sulla modifica genetica degli organismi stessi. Ciò ha portato a importanti sviluppi e applicazioni in diversi settori. Ad esempio, nel campo della salute, le biotecnologie moderne hanno consentito la produzione di farmaci ricombinanti, come l'insulina umana prodotta da batteri geneticamente modificati. Questo ha reso i farmaci più disponibili e accessibili. Inoltre, sono state sviluppate terapie geniche che mirano a correggere i difetti genetici responsabili di malattie ereditarie. Nell'agricoltura, le biotecnologie moderne hanno dato origine ai cosiddetti organismi geneticamente modificati (OGM). Attraverso la manipolazione genetica, gli scienziati sono stati in grado di conferire alle piante caratteristiche desiderabili, come la resistenza alle malattie o agli insetti, la tolleranza agli erbicidi o una maggiore resa. Tuttavia, l'uso degli OGM è stato oggetto di dibattiti e controversie a causa di preoccupazioni legate alla sicurezza e agli impatti ambientali. Le biotecnologie moderne sono state applicate anche in altri settori, come l'industria alimentare, la produzione di biocarburanti, la pulizia ambientale e la produzione di materiali biodegradabili. La tecnica di editing del genoma CRISPR-Cas9 ha rivoluzionato il campo, consentendo modifiche precise e più efficienti al DNA. È importante sottolineare che l'applicazione delle biotecnologie, sia tradizionali che moderne, solleva questioni etiche, legali e sociali che richiedono una valutazione attenta e una regolamentazione appropriata. In conclusione, la storia delle biotecnologie comprende sia le pratiche tradizionali di selezione e utilizzo degli organismi viventi, sia l'avvento delle biotecnologie moderne basate sulla manipolazione genetica. Queste ultime hanno aperto nuove possibilità e sfide in diversi settori, con importanti implicazioni per la salute, l'agricoltura, l'industria e l'ambiente.

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L'avvento delle biotecnologie moderne

Le moderne biotecnologie hanno rivoluzionato diversi settori oltre all'agricoltura. Grazie all'ingegneria genetica, è possibile introdurre geni provenienti da specie diverse negli organismi, creando organismi geneticamente modificati (OGM). Questi OGM possono essere transgenici, se contengono geni provenienti da specie diverse, o cisgenici, se i geni provengono dalla stessa specie. Le applicazioni delle moderne biotecnologie vanno oltre l'agricoltura e includono anche la salute e la salvaguardia dell'ambiente. Nella salute, le biotecnologie consentono la produzione di farmaci ricombinanti, come l'insulina umana prodotta da batteri geneticamente modificati. Sono state sviluppate anche terapie geniche che mirano a correggere difetti genetici responsabili di malattie ereditarie. Nel settore dell'ambiente, le biotecnologie moderne offrono soluzioni per la pulizia ambientale, come l'utilizzo di microrganismi geneticamente modificati per degradare inquinanti. Inoltre, sono state sviluppate piante geneticamente modificate per resistere a condizioni ambientali avverse o per migliorare l'efficienza della produzione di biocarburanti. Le biotecnologie rappresentano uno strumento potente per affrontare sfide globali come la sicurezza alimentare, la sostenibilità ambientale e la salute umana. Tuttavia, il loro utilizzo solleva questioni etiche, legali e sociali che richiedono una valutazione attenta e una regolamentazione adeguata per garantire la sicurezza e minimizzare gli impatti negativi sull'ambiente e sulla salute umana.

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Le tecniche dell'ingegneria genetica

L'ingegneria genetica, o tecnologia del DNA ricombinante, è l'insieme di tecniche che permettono di modificare direttamente l'informazione genetica di un organismo attraverso la manipolazione del DNA. Questo consente di alterare in modo mirato il fenotipo di un organismo, agendo sul suo genotipo. Gli strumenti fondamentali utilizzati sono gli enzimi di restrizione e le DNA ligasi, che permettono di tagliare e incollare il DNA in posizioni specifiche. Questa tecnologia ha aperto nuove possibilità in diversi settori, come la produzione di farmaci ricombinanti, la modifica delle piante coltivate, la creazione di organismi geneticamente modificati e la terapia genica umana. Tuttavia, l'ingegneria genetica solleva importanti questioni etiche e richiede una regolamentazione adeguata per garantire la sicurezza e minimizzare gli impatti negativi.

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Tagliare il DNA

Per generare un DNA ricombinante, è necessario individuare le parti di DNA desiderate all'interno dei genomi degli organismi di partenza e unirle insieme. Questo processo richiede l'utilizzo di enzimi di restrizione, che sono in grado di tagliare il DNA in posizioni specifiche. Gli enzimi di restrizione agiscono sul legame fosfodiesterico tra i nucleotidi adiacenti e riconoscono sequenze specifiche chiamate siti di restrizione. Questi enzimi possono tagliare entrambi i filamenti del DNA e la maggior parte delle sequenze bersaglio sono palindrome. Uno degli enzimi di restrizione comunemente utilizzati è EcoRI, che taglia il DNA in corrispondenza della sequenza palindroma 5'-GAATTC-3'/3'-CTTAAG-5', generando estremità sfalsate chiamate coesive (sticky ends). Altri enzimi, come EcoRV, effettuano il taglio nel mezzo della sequenza di riconoscimento, generando estremità piatte chiamate blunt ends. La lunghezza dei frammenti di restrizione varia a causa delle sequenze di riconoscimento non regolari. Questa caratteristica permette di distinguere e separare i diversi frammenti di restrizione, inclusi quelli di interesse particolare.

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L'elettroforesi su gel

L'elettroforesi su gel è una tecnica utilizzata per separare e visualizzare i frammenti di DNA in base alla loro dimensione e carica. Ci sono due tipi comuni di gel utilizzati per l'elettroforesi del DNA: l'agarosio e la poliacrilammide. L'agarosio è un polisaccaride naturale che forma una rete tridimensionale quando solidifica. I frammenti di DNA possono migrare attraverso i pori della rete di agarosio durante l'elettroforesi. La percentuale di agarosio utilizzata nel gel determina la dimensione dei pori e quindi la gamma di dimensioni dei frammenti di DNA che possono essere separati. Gli agarosi con una percentuale più bassa di agarosio (0,5-2%) sono utilizzati per separare frammenti di DNA di grandi dimensioni, mentre gli agarosi con una percentuale più alta (1,5-3%) sono utilizzati per frammenti di dimensioni più piccole. La poliacrilammide, d'altra parte, è un polimero sintetico che forma una matrice gelatinosa di pori più piccoli rispetto all'agarosio. Viene utilizzato per la separazione di frammenti di DNA di dimensioni più ridotte, come quelli derivanti dalla PCR o dalla digestione con enzimi di restrizione. La concentrazione di acrilammide nel gel determina la dimensione dei pori e quindi la risoluzione della separazione. Gel di poliacrilammide al 4-8% vengono comunemente utilizzati per la separazione di frammenti di DNA di 20-500 paia di basi. Durante l'elettroforesi su gel, il gel di agarosio o poliacrilammide viene preparato in una struttura reticolare, solitamente in una piastra di vetro o plastica chiamata "gel di elettroforesi". Il campione di DNA viene caricato su una delle estremità del gel e viene applicato un campo elettrico. A causa della carica negativa del DNA, i frammenti migrano verso l'anodo, il polo positivo. La velocità di migrazione dipende dalla dimensione e dalla carica del frammento di DNA. I frammenti di DNA più piccoli migrano più velocemente attraverso i pori del gel, mentre quelli di dimensioni maggiori migrano più lentamente. Dopo l'elettroforesi, il gel viene colorato con un colorante che si lega al DNA, come il bromuro di etidio, per visualizzare i frammenti di DNA. L'immagine del gel viene acquisita utilizzando un sistema di imaging ultravioletta o una fotocamera digitale e viene analizzata per determinare le dimensioni approssimative dei frammenti di DNA. L'elettroforesi su gel è una tecnica fondamentale in biologia molecolare che trova applicazioni in vari ambiti, come la genetica, la diagnostica molecolare, la biologia forense e la ricerca scientifica.

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Ricucire il DNA

Una volta ottenuti i frammenti di DNA tramite un enzima di restrizione, è necessario unirli alla molecola ricevente per creare il DNA ricombinante. Questo processo viene facilitato dall'utilizzo di enzimi chiamati DNA ligasi. Le DNA ligasi sono in grado di ricostituire il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti, utilizzando l'ATP come cofattore. Questi enzimi sono presenti in tutte le cellule viventi poiché sono essenziali per le reazioni di replicazione e riparazione del DNA. Durante la replicazione del DNA, ad esempio, i frammenti di Okazaki, sintetizzati a partire dal filamento ritardato, vengono uniti tra loro proprio da una DNA ligasi. Immaginiamo di aver ottenuto due frammenti di DNA provenienti da organismi diversi tramite il taglio con l'enzima di restrizione EcoRI. Se mescoliamo questi due frammenti, si uniranno spontaneamente grazie alle estremità coesive complementari. Tuttavia, questa unione sarà debole poiché è mantenuta solo dai legami a idrogeno tra le basi e i frammenti tenderanno a separarsi. Aggiungendo una DNA ligasi, i due frammenti saranno uniti in modo covalente attraverso la formazione del legame fosfodiesterico, che è un legame covalente più stabile. Alcune DNA ligasi, come quella del batteriofago T4, sono in grado anche di saldare estremità piatte. Dunque, questa reazione è meno efficiente poiché i due frammenti non si uniscono spontaneamente, a causa della mancanza di estremità complementari. L'utilizzo delle DNA ligasi è essenziale nel clonaggio del DNA e in molte altre tecniche di ingegneria genetica, in cui è necessario unire frammenti di DNA per creare costrutti molecolari ricombinanti.

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I vettori plasmidici

I vettori plasmidici sono molecole di DNA circolare a doppia elica utilizzate come sistemi di trasporto per il trasferimento di geni da un organismo all'altro. I plasmidi batterici, opportunamente modificati, sono ampiamente utilizzati come vettori plasmidici in laboratorio. I vettori plasmidici contengono diversi elementi essenziali che consentono il loro utilizzo efficace: 1. Origine di replicazione: è una sequenza di DNA che permette la replica del plasmide all'interno delle cellule ospiti. L'origine di replicazione consente la duplicazione del plasmide ogni volta che la cellula si divide, assicurando che tutte le cellule figlie contengano il plasmide e i geni che trasporta. 2. Geni per la resistenza agli antibiotici: i vettori plasmidici spesso contengono geni che conferiscono resistenza agli antibiotici. Questi geni, noti come geni reporter, consentono la selezione delle cellule che contengono il plasmide. Le cellule trasformate con il plasmide possono sopravvivere in presenza di specifici antibiotici, mentre le cellule non trasformate vengono eliminate. 3. Siti di clonaggio: i vettori plasmidici contengono sequenze uniche di riconoscimento per diversi enzimi di restrizione. Queste sequenze sono posizionate vicine l'una all'altra in una regione del plasmide chiamata sito multiplo di clonaggio. Il sito multiplo di clonaggio consente l'inserimento del frammento di DNA esogeno nel plasmide. Gli enzimi di restrizione tagliano il plasmide e il frammento di DNA esogeno in corrispondenza dei siti di riconoscimento, consentendo la creazione di estremità coesive compatibili per la successiva unione tramite la DNA ligasi. I vettori plasmidici sono strumenti fondamentali nella tecnologia del DNA ricombinante e nel clonaggio del DNA. Consentono il trasferimento efficiente dei geni desiderati e sono ampiamente utilizzati in molte applicazioni biotecnologiche e di ingegneria genetica.

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Il clonaggio

Dopo aver trasformato le cellule ospiti con il vettore plasmidico contenente il gene di interesse, è necessario selezionare le cellule che effettivamente hanno incorporato il plasmide. Questa selezione avviene tramite l'uso di un gene reporter per la resistenza agli antibiotici presente nel vettore. Le cellule trasformate vengono coltivate in un terreno di coltura contenente l'antibiotico specifico per la resistenza conferita dal gene reporter presente nel vettore. Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide e quindi esprimono il gene per la resistenza possono sopravvivere alla presenza dell'antibiotico. Le cellule che non hanno incorporato il plasmide o non esprimono il gene reporter vengono eliminate. In questo modo, si ottiene una coltura pura di cellule che contengono il DNA esogeno desiderato. Ogni volta che queste cellule si dividono, i geni presenti nel plasmide, incluso il gene di interesse, vengono duplicati insieme ai geni cellulari. Poiché le cellule batteriche possono dividersi rapidamente, dopo diverse divisioni si otterrà una popolazione di cloni geneticamente identici, cioè cellule contenenti copie multiple del gene inserito. È importante sottolineare che il termine "clonaggio" nel contesto del DNA ricombinante si riferisce alla produzione di molte copie identiche di un frammento di DNA, mentre il termine "clonazione" si riferisce alla creazione di organismi geneticamente identici. Nel contesto del clonaggio del DNA, l'obiettivo è amplificare e isolare il DNA di interesse, non la creazione di organismi completi. È possibile che il plasmide si richiuda su sé stesso senza includere il frammento di DNA di interesse. Per evitare questo problema, il DNA da clonare viene inserito in un gene marcatore che consente di distinguere le colonie batteriche che contengono l'inserto di DNA desiderato. Questo gene marcatore può essere associato a una specifica colorazione o ad altre caratteristiche che consentono di identificare visivamente le colonie contenenti l'inserto di interesse.

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La reazione a catena della polimerasi

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di amplificazione del DNA che permette di ottenere un gran numero di copie identiche di un frammento specifico. La PCR si basa su un ciclo di tre fasi principali: denaturazione, appaiamento dei primer (annealing) ed estensione. La PCR richiede i seguenti componenti: 1. DNA template: il DNA di partenza contenente la sequenza da amplificare. 2. Primer: brevi sequenze di DNA complementari alle sequenze di interesse che fungono da punto di inizio per l'estensione del DNA. 3. Taq polimerasi: una DNA polimerasi termoresistente isolata dal batterio Thermus aquaticus. La Taq polimerasi è stabile a temperature elevate, quindi può resistere alle alte temperature necessarie per denaturare il DNA. 4. Nucleotidi trifosfato (dNTP): i blocchi costitutivi del DNA necessari per la sintesi del nuovo filamento di DNA. 5. Cofattori: solitamente sali di magnesio (Mg2+) che sono essenziali per l'attività della Taq polimerasi. Il processo di PCR può essere completato in circa 2-3 ore, a seconda delle necessità sperimentali. La capacità di amplificare selettivamente una sequenza di DNA ha reso la PCR una tecnica essenziale in molti ambiti della biologia molecolare e della diagnostica genetica.

Il ciclo di amplificazione della PCR comprende diverse ripetizioni delle seguenti fasi: 1. Denaturazione: la miscela reattiva viene riscaldata a una temperatura superiore ai 90 °C, causando la separazione dei due filamenti del DNA template. 2. Appaiamento dei primer (Annealing): la temperatura viene abbassata per favorire l'associazione dei primer alle sequenze complementari presenti sui filamenti del DNA template. 3. Estensione: la temperatura viene aumentata a una temperatura ottimale per l'attività della Taq polimerasi (di solito intorno a 72 °C). La Taq polimerasi utilizza i primer come punto di partenza e sintetizza una copia complementare della sequenza di DNA tra i due primer. Questi tre passaggi vengono ripetuti in modo ciclico, con ogni ciclo che porta a un'ulteriore amplificazione geometrica del DNA target. Dopo un certo numero di cicli, l'amplificazione raggiunge un livello che permette la rilevazione o l'utilizzo del DNA amplificato per analisi o applicazioni specifiche.

Grazie per l' attenzione!

Realizzato da: Alessi Gianmarco Parisi Michele