bioreattore

Bioreattore.

produzioni biotecnologiche

Indice

1. Definizione

6.Preparazione inoculo

2. Classificazione bioreattori

7.Recupero prodotti

3. Come funziona?

4.Costo bioreattore

5.I terreni di coltura

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Definizione di bioreattore

cos'è un bioreattore?

Si definisce bioreattore ogni apparecchiatura in grado di fornire un ambiente adeguato alla crescita di organismi biologici.

Si tratta in genere di un recipiente all'interno del quale viene portata a termine una reazione chimica svolta da microorganismi o da sostanze da essi derivate, attive dal punto di vista biochimico. Questo tipo di bioreattori è solitamente di forma cilindrica, composto di acciaio inossidabile e può raggiungere dimensioni comprese tra alcuni litri e numerosi ettolitri.Ci si riferisce a bioreattori anche intendendo dispositivi che permettono la crescita autonoma di cellule o tessuti. Questo concetto di bioreattore, affine a quello di coltura cellulare, è attualmente in largo sviluppo soprattutto nel settore della rigenerazione dei tessuti.

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Classificazione dei bioreattori.

come li classifichiamo?

È possibile classificare i bioreattori in base a tre diversi parametri:

1.Asetticità del contenitore.Esistono contenitori:

• non asettici, usati ad esempio in fermentazioni tradizionali come la birrificazione o più moderne come il trattamento delle acque reflue;
• asettici, utilizzati per la produzione di antibiotici, vitamine, proteine e qualsiasi altro composto di interesse.

2.Condizioni richieste dal bioprocesso.I bioprocessi possono avere luogo:

• in fermentatori continuamente rimescolati o meno;
• in aerobiosi o in anaerobiosi;
• in sospensione (mezzo liquido) o su una superficie di supporto (solida).

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3.Modalità di coltura dei microrganismi.Bioreattore da laboratorio per coltivare microrganismi:I metodi di coltura dei microrganismi in un bioreattore possono essere essenzialmente cinque. Risulta importante per questa classificazione il metodo di somministrazione del terreno di coltura, ovvero dei fattori necessari ai microrganismi per crescere.

• Colture in batch (a sistema chiuso). Il volume di terreno liquido nel quale i microrganismi crescono è essenzialmente costante. I microrganismi, crescendo, aumentano la loro biomassa, riducono la quantità di nutrienti disponibile, producono metaboliti da eliminare. Le cellule raggiungono così un livello (detto stato stazionario) tale da impedire di aumentare ulteriormente il loro numero.
• Colture in fed batch (sistema chiuso alimentato). Questo sistema permette di prolungare il tempo di crescita dei microrganismi prima di raggiungere lo stato stazionario. Un substrato limitante la crescita viene infatti continuamente addizionato alla coltura.
• Colture in perfusione. Oltre all'aggiunta di terreno fresco, viene anche prelevato il terreno usato privo di cellule ed i metaboliti escreti. È un metodo ampiamente usato nelle colture di cellule animali.
• Colture continue. Ad una coltura in batch in fase di crescita esponenziale si addiziona una certa quantità di terreno fresco e se ne sottrae una equivalente di terreno usato con cellule. In questo modo, restando costante la biomassa, si ottiene una crescita pressoché bilanciata: anche le concentrazioni di sostanze nutrienti e di metaboliti, infatti, restano essenzialmente costanti. Colture simili sono anche quelle dette semicontinue.
• Colture su strato solido. Si svolgono in assenza di acqua allo stato libero. Tra i substrati solidi più utilizzati figurano legumi, cereali, ed altri materiali di origine vegetale come paglia o segatura.

CARATTERISTICHE:

• Grandi dimensioni
• Acciaio inossidabile elettrolucidato
• Forma cilindrica con aperture di ingresso e di uscita asservite da valvole

• Sistema di agitazione meccanica o pneumatica

• Sistemi di aerazione (se destinati a trasformazioni aerobiche)

• Sistemi di termostatazione
• Manometri per il controllo della pressione interna
• Controllo online dei parametri di processo: temperatura, pH, ossigeno disciolto, velocità di agitazione, pressione interna, livello di schiuma, flusso di gas

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Classificazione in base alla tipologia costruttiva:

• monofasico: i costituenti del sistema di reazione sono tutti in fase acquosa e costituiscono una miscela omogenea
• multifasico: almeno un costituente è presente anche in fase solida o gassosa

Bifasici (fase acquosa e fase solida):

• a letto fisso: colonna di materiale inerte sulla quale è stato immobilizzato il biocatalizzatore
• a letto fluido: la sospensione di particelle solide su cui è immobilizzato il biocatalizzatore sedimenta nella parte superiore del bioreattore, sospinta dal un flusso d’aria

Reattore anaerobico o digestore: bioreattore trifasico (fase liquida, solida e gassosa), impiegato nel trattamento dei fanghi di depurazione e con produzione di biogas (es. metano).

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IMMAGINI DI BIOREATTORI

bioreattore da laboratorio per coltivare microrganismi

bioreattori a membrana

struttura di un fermentatore

Riguardo i bioreattori a membrana:

I bioreattori a membrana (MBR) combinano il processo di separazione della membrana con un trattamento biologico delle acque di scarico. La tecnologia MBR offre diversi vantaggi rispetto al trattamento biologico convenzionale. Consente di ottenere acque reflue di alta qualità adatte al riciclo, riduce l'esigenza di suolo del 50% e diminuisce la produzione di fanghi biologici.

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Come funziona un bioreattore?

Iniziamo:

La coltivazione di cellule procariotiche ed eucariotiche su scala laboratorio può avvenire in sistemi semplici rappresentati dalle beute o in sistemi più complessi ed accurati rappresentati dai fermentatori o bioreattori.

Parametri:

Esso è in grado di assicurare una condizione di sterilità e fornire alle cellule tutto ciò di cui necessitano, permettendo allo stesso tempo di monitorare in maniera semplice e veloce tutti i parametri di crescita. Uno dei parametri più importanti è la temperatura, la quale durante la crescita cellulare tende ad aumentare a causa delle reazioni esotermiche collegate al metabolismo microbico. Un suo incremento eccessivo causerebbe un rallentamento della crescita cellulare o in casi estremi la morte della coltura. Per questo motivo un termometro collegato all’unità di comando è immerso nel brodo di coltura per monitorare costantemente il suo valore. L’isotermia è garantita da una camicia posta a rivestimento del vessel di vetro in cui scorre dell’acqua a temperatura controllata. L’agitazione è garantita da una serie di pale rotanti collegate ad un motore, solitamente posto in testa al bioreattore. La forma, la dimensione, la distanza e la velocità di rotazione delle pale può essere modificata a seconda delle esigenze. Le pale sono fondamentali non solo per miscelare le cellule e i nutrienti, che vengono forniti sterilizzati e filtrati mediante una pompa in entrata, ma anche per disciogliere al meglio l’ossigeno che viene fornito dal basso sotto forma di bolle. Inoltre, un elemento fondamentale all’interno del vessel di vetro è rappresentato dai frangi-flussi, la cui funzione è appunto quella di rompere flussi rotativi fissi che creerebbero delle zone non omogenee all’interno del mezzo di coltura. Nel caso in cui l’organismo coltivato sia un anaerobio stretto, ovvero non sopravviva in presenza di ossigeno, viene semplicemente insufflato azoto nel mezzo di coltura piuttosto che aria. In caso di coltura di cellule molto sensibili agli stress meccanici dovuti alle pale, l’agitazione è garantita mediante l’insufflazione di un potente getto d’aria compressa sterile. Bioreattori dotati di questa tipologia di agitazione prendono il nome di air-lift.

I principali parametri sono monitorati mediante sensori di pH, temperatura, ossigeno e schiuma collegati all’unità di comando che, innesca una risposta appropriata per riportare le condizioni alterate a quelle desiderate ed ottimali per la crescita cellulare. Ad esempio, se con l’aumento della biomassa cellulare dovesse verificarsi un aumento della CO2 prodotta e quindi una diminuzione del pH, a causa della sua solubilizzazione nel mezzo di coltura con formazione di acido carbonico, l’unità di comando attiverebbe la pompa collegata alla riserva di soluzione basica concentrata per introdurre nel sistema un piccolo volume di soluzione tale da riportare il pH al valore ottimale impostato. Un meccanismo analogo si attiva in caso di aumento del pH con l’introduzione di una soluzione acida. Analogamente, in caso di formazione di schiuma, dovuta all’agitazione, una apposita sonda, posta ad una altezza desiderata, ne rileva la presenza ed attiva la pompa collegata alla riserva di anti-schiuma. Infine, tramite una valvola in uscita è possibile raccogliere in modo sterile un campione del mezzo di coltura su cui effettuare separatamente una serie di analisi per misurare la concentrazione cellulare, i nutrienti ancora presenti nel mezzo di coltura ed i prodotti di fermentazione. Infine, alcuni bioreattori sono dotati di sensori di gas per la quantificazione della CO2 o dell’H2 (nel caso di microrganismi metanogeni).

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Costo di un bioreattore

quanto costa all'incirca?

4.Quanto costa un bioreattore innovativo?

€60.000/l

impianto pilota 20/30 milioni di euro

«Il nostro bioreattore da laboratorio costa circa 60 mila euro nella capacità di un litro. Un impianto pilota costerebbe dai 20 ai 30 milioni, lo stesso prezzo di un impianto a vecchia tecnologia con efficienza e tempistiche più veloci».

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I terreni di coltura per la microbiologia industriale

I terreni di coltura possono essere:

• sintetici: utilizzati in laboratorio, contengono materie prime pure

• complessi: impiegati in microbiologia industriale, contengono materie prime grezze che richiedono pretrattamenti

Fonti di carbonio: CO2, carboidrati in forma pura (es. lattosio o glucosio) o grezza (derivano da diverse fonti es. melasse, cellulosa ecc.)Fonti di azoto: composti inorganici (sali di ammonio), composti organici (aminoacidi e proteine, urea), materie prime grezze (es. acqua di macerazione del mais) Fonti di vitamine: ingredienti delle materie prime grezze utilizzate. Possono essere integrate con altre sorgenti (es. estratto di lievito). Minerali: dall’acqua di fonte e dalle materie prime grezze impiegate. Se necessario, si possono aggiungere sali di calcio, fosforo, potassio, cloro, magnesio. Agenti antischiuma: sostanze ad azione tensioattiva che riducono la tensione superficiale, limitando la formazione di schiuma. Si impiegano oli naturali e sintetici.

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Sistemi tampone per la correzione del pH: carbonato di calcio (se il sistema è acido) o fosfati (se alcalino).Precursori: sono incorporati dai microrganismi e andranno a formare parti della molecola che il microrganismo è chiamato a produrre; la resa è altamente potenziata (es. acido fenilacetico, precursore della molecola di penicillina G). Acqua: importante per il calcolo dei volumi necessari alla preparazione dei terreni di coltura, la conduzione degli impianti, le sue caratteristiche e composizione in oligoelementi.

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Fasi della preparazione dell'inoculo

5.Le fasi produttive: preparazione dell’inoculo

In ogni processo biotecnologico intervengono due componenti fondamentali: • la materia prima che costituisce il substrato • i biocatalizzatori con cui esso è inoculato Il ceppo microbico deve rispettare alcune caratteristiche: • facilità di coltivazione e manipolazione • assenza di qualsiasi carattere di patogenicità • alta velocità di riproduzione • elevata capacità produttiva (ceppo alto-produttore) • stabilità genetica (bassa frequenza di mutazione) L'inoculo è un insieme di propaguli (elementi infettivi nel caso di un patogeno).

Le fasi della procedura di scale-up:

Procedura di scale-up: trasferimento della coltura-starter da un microambiente (provetta) ai contenitori industriali (migliaia di litri). Si articola in fasi successive nelle quali l’inoculo è trasferito in contenitori di volume progressivamente maggiore, intervallate da periodi di incubazione in condizioni controllate.1. Una quota è prelevata dal terreno di conservazione e seminata su slant e incubata 2. La coltura è trasferita dallo slant in provette di terreno liquido (riproduzione più veloce); quando la concentrazione di cellule aumenta, viene trasferita in contenitori progressivamente più capienti. 3. La brodocoltura è travasata in minifermentatori in condizioni operative equivalenti al fermentatore finale 4. Trasferimento al bioreattore di produzione

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Fase di recupero dei prodotti

Il recupero dei prodotti:

Al termine di un processo mediato da microrganismi si deve procedere alla separazione della biomassa dal brodo di coltura residuo per centrifugazione o per filtrazione.

• Obiettivo recupero della biomassa: rimane come prodotto residuo da eliminare il terreno di coltura esaurito, con separazione e lavaggio.
• Obiettivo recupero di metaboliti: è la biomassa a essere eliminata, per procedere poi alla separazione e purificazione dal filtrato colturale (se si tratta di metaboliti endocellulari occorre rompere degli involucri cellulari).

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Fine!Giuseppe Selicato