PRESENTAZIONE
Trasformazione batterica con pGLO
Cagnin Mattia - Caccaro Tommaso
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INDICE INTERATTIVO
Clicca sui riquadri per andare direttamente nelle slide desiderate
Semina
Scopo
Materiali e reagenti
osservazioni
Preparazione piastre
osservazioni foto
conclusioni
trasformazione
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Scopo?
Osservare comportamento e caratteristiche dell'escherichiacoli trasformato con plasmide della medusa bioluminescente "Acquera Victoria"
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MAteriali e reagenti
Materiali: -4 piastre petri -2 becchi bunsen -Anse -Becher -Portaprovette in schiuma -Bagno termostatico (42°C) -Incubatore (37°C) -Ghiaccio -4 Microprovette -Pipette monouso
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MAteriali e reagenti
Reagenti: -Plasmide pGLO -Arabinosio -Terreno LB -E. coli -Ampicillina -Soluzione di trasformazione (CaCl2)
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PROcedimento
Preparazione delle piastre
In primis bisogna procedere con la preparazione di 4 piastre rispettivamente contenenti: 1° piastra: terreno LB 2°/3° piastra: terreno LB+ampicillina 4° piastra: terreno LB+ampicillina+arabinosioPreparazione terreno-Calcolare la quantità di terreno da disciogliere in acqua di terreno LB -Introdurre la quantità misurata in un becher contenente acqua e porre il tutto sopra un bunsen mescolando fino all'ebollizione -Trasferire il terreno dentro la prima piastra (circa 20ml) -Aggiungere poi al terreno una certa quantità di ampicillina per la preparazione della seconda e della terza piastra ed infine introdurre nel restante terreno una data quantità di arabinosio per completare la preparazione dell'ultima piastra
avanti
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PROcedimento
trasformazione batterica
Adesso si andà a preparare le microprovette contenenti i ceppi di E.coli sia quello senza plasmide che quello modificato-Siglare 2 microprovette, scrivendo +pGLO e -pGLO (pGLO è il plasmide della medusa bioluminescente) e porle del portaprovette in schiuma -Aggiungere poi 250μl di soluzione di trasformazione in ciascuna microprovetta -Porre le microprovette nel becher contenente ghiaccio fino al loro raffreddamento -Prelevare con un ansa sterila una colonia di E.coli ed inserirla all'interno delle microprovette, e aggiungere il plasmide nele provette +pGLO -Incubare le microprovette in ghiaccio per 10 minuti; nello stesso tempo marcare le piastre con la dicitura +pGLO nella prima e nella seconda, e -pGLO nella terza e nella quarta -Porre poi le provette nel bagno termostatico per 50 secondi esatti, trascorsi i secondi reintrodurre le provette in ghiaccio per 2 minuti (per una trasformazione ottimale i passaggi ghiaccio acqua calda devone essere più rapidi possibili), rimuoverle poi dal ghiaccio ed inserire in ciascuna microprovetta 250μl di LB liquido ed incubarle 10 minuti a 37°C
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PROcedimento
Semina
A questo punto andremo a seminare le piastre precedentemente preparate con il contenuto delle due microprovette-inserire 100μl di ogni microprovetta nelle rispettive piastre (piastre +pGLO/microprovetta +pGLO e piastre -pGLO/provetta -pGLO) -Distendere in maniera omogenea tutto il liquido nelle piastre mediante delle anse sterili -successivamente impilare le piastre e porle capovolte all'interno dell'incubatore alla temperatura di 37°C È doveroso aggiungere che prima di inserire il plasmide all'interno delle microprovette abbiamo avuto modo di osservarlo sotto la luce della lamada a raggi UV in modo tale poter annotare delle informazioni che serviranno con il procedere di questa esperienza
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Osservazioni
Cossa abbiamo visto:
Piastra LB (-pGLO)Normale crescita di E.coli, colonie di colore giallo pallido, e dalla forma tendente al circolare Ai raggi UV non abbiamo osservato alcuna fluorescenza
Piastra LB+amp (+pGLO)Si nota la crecita di varie colonie di forma abbastanza circolare e dal colore giallo pallido, rispetto a quelle sulla piastra appaiono più grandi Non abbiamo nessun tipo di fluorescenza alla luce dei raggi UV
Piastra LB+amp (-pGLO)Non è cresciuto nulla Come prima ai raggi UV non si è presentata alcuna fluorescenza
Piastra LB+amp+ara (+pGLO)Si nota una crescita maggiore rispetto alle piastre precedenti. Ai raggi UV anche qui non abbiamo osservato fluorescenza
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osservazioni
Foto
Piastra LB (-pGLO)
Piastra LB+amp (-pGLO)
Piastra LB+amp+ara(+pGLO)
Piastra LB+amp (+pGLO)
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conclusioni
Come abbiamo sottolineato nelle osservazioni vi è una crescita batterica nele piastre con LB (-pGLO), con LB+amp (+pGLO) e LB+amp+ara (+pGLO); il motivo per cui nella piastra con LB+amp (-pGLO) non si sono sviluppate colonie batteriche è dto dall'introduzione dell'antibiotico ampicillina, che ha inibito la crescita batterica di questo ceppo, mentre nella rispettiva piastra con i batteri +pGLO si è verificata una resistenza all'antibiotico amp. a causa dell'introduzione del plasmide che ha portato ad una trasformazione genica, con la produzione di proteine che hanno portato a tale caratteristica. Riprendendo ciò che abbiamo avuto modo di osservare si è notato come, al contrario delle ipotesi, non ci fosse alcuna forma di bioluminescenza in alcuna delle 4 piastre, era infatti previsto che nella piastra contenente LB+amp+ara (+pGLO) si sarebbe notata una fluorescenza sotto i raggi UV; la nostra ipotesi della mancanza di questa caratteristica è che i btteri abbiano consumato tutto l'arabinosio contenuto nel terreno, la bioluminescenza in questi batteri è infatti causata dalla combinazione di un determinato plasmide e d un ambiente tale da potere attivare i geni dei batteri trasformati, in questo caso proprio l'arabinosio. Come verifica di questa ipotesi si può notare come nella microperovetta contenente il plasmide non ci fosse alcuna bioluminescenza sotto i raggi UV confermando ciò che abbiamo precedentemente affermato
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conclusioni
Altre piastre contenenti LB+amp+ara (+pGLO) presentavano un grado di bioluminescenza differente, in alcune infatti era facilmente osservabile in molte colonie, in altre invece era possibile notarla in misura minore.Come detto prima alla base di questa diversità c'è molto probabilmente la diversa concentrazione di arabinosio nelle piastre, che comporta quindi ad un attivazione maggiore o minore dei geni legati alla bioluminescenza
La foto rappresenta una delle piastre dopo qualche ora dall'incubazione, e si vede facilmente come almeno all'inizio in ogni piastra ci fosse un elevato livello di fluorescenza.A maggior ragione possiamo dire come l'arabinosio nei giorni a seguire sia stato impiegato nelle attività metaboliche dei batteri, portando quindi le piastre ad una dimunizione diminuzione generale dello zucchero e di conseguenza dell'intensità della bioluminescenza
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grazie
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Fine
Trasformazione batterica con pGLO
Cagnin
Created on March 17, 2023
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Trasformazione batterica con pGLO
Cagnin Mattia - Caccaro Tommaso
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Materiali e reagenti
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Materiali: -4 piastre petri -2 becchi bunsen -Anse -Becher -Portaprovette in schiuma -Bagno termostatico (42°C) -Incubatore (37°C) -Ghiaccio -4 Microprovette -Pipette monouso
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Reagenti: -Plasmide pGLO -Arabinosio -Terreno LB -E. coli -Ampicillina -Soluzione di trasformazione (CaCl2)
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Preparazione delle piastre
In primis bisogna procedere con la preparazione di 4 piastre rispettivamente contenenti: 1° piastra: terreno LB 2°/3° piastra: terreno LB+ampicillina 4° piastra: terreno LB+ampicillina+arabinosioPreparazione terreno-Calcolare la quantità di terreno da disciogliere in acqua di terreno LB -Introdurre la quantità misurata in un becher contenente acqua e porre il tutto sopra un bunsen mescolando fino all'ebollizione -Trasferire il terreno dentro la prima piastra (circa 20ml) -Aggiungere poi al terreno una certa quantità di ampicillina per la preparazione della seconda e della terza piastra ed infine introdurre nel restante terreno una data quantità di arabinosio per completare la preparazione dell'ultima piastra
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trasformazione batterica
Adesso si andà a preparare le microprovette contenenti i ceppi di E.coli sia quello senza plasmide che quello modificato-Siglare 2 microprovette, scrivendo +pGLO e -pGLO (pGLO è il plasmide della medusa bioluminescente) e porle del portaprovette in schiuma -Aggiungere poi 250μl di soluzione di trasformazione in ciascuna microprovetta -Porre le microprovette nel becher contenente ghiaccio fino al loro raffreddamento -Prelevare con un ansa sterila una colonia di E.coli ed inserirla all'interno delle microprovette, e aggiungere il plasmide nele provette +pGLO -Incubare le microprovette in ghiaccio per 10 minuti; nello stesso tempo marcare le piastre con la dicitura +pGLO nella prima e nella seconda, e -pGLO nella terza e nella quarta -Porre poi le provette nel bagno termostatico per 50 secondi esatti, trascorsi i secondi reintrodurre le provette in ghiaccio per 2 minuti (per una trasformazione ottimale i passaggi ghiaccio acqua calda devone essere più rapidi possibili), rimuoverle poi dal ghiaccio ed inserire in ciascuna microprovetta 250μl di LB liquido ed incubarle 10 minuti a 37°C
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A questo punto andremo a seminare le piastre precedentemente preparate con il contenuto delle due microprovette-inserire 100μl di ogni microprovetta nelle rispettive piastre (piastre +pGLO/microprovetta +pGLO e piastre -pGLO/provetta -pGLO) -Distendere in maniera omogenea tutto il liquido nelle piastre mediante delle anse sterili -successivamente impilare le piastre e porle capovolte all'interno dell'incubatore alla temperatura di 37°C È doveroso aggiungere che prima di inserire il plasmide all'interno delle microprovette abbiamo avuto modo di osservarlo sotto la luce della lamada a raggi UV in modo tale poter annotare delle informazioni che serviranno con il procedere di questa esperienza
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Osservazioni
Cossa abbiamo visto:
Piastra LB (-pGLO)Normale crescita di E.coli, colonie di colore giallo pallido, e dalla forma tendente al circolare Ai raggi UV non abbiamo osservato alcuna fluorescenza
Piastra LB+amp (+pGLO)Si nota la crecita di varie colonie di forma abbastanza circolare e dal colore giallo pallido, rispetto a quelle sulla piastra appaiono più grandi Non abbiamo nessun tipo di fluorescenza alla luce dei raggi UV
Piastra LB+amp (-pGLO)Non è cresciuto nulla Come prima ai raggi UV non si è presentata alcuna fluorescenza
Piastra LB+amp+ara (+pGLO)Si nota una crescita maggiore rispetto alle piastre precedenti. Ai raggi UV anche qui non abbiamo osservato fluorescenza
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Foto
Piastra LB (-pGLO)
Piastra LB+amp (-pGLO)
Piastra LB+amp+ara(+pGLO)
Piastra LB+amp (+pGLO)
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Come abbiamo sottolineato nelle osservazioni vi è una crescita batterica nele piastre con LB (-pGLO), con LB+amp (+pGLO) e LB+amp+ara (+pGLO); il motivo per cui nella piastra con LB+amp (-pGLO) non si sono sviluppate colonie batteriche è dto dall'introduzione dell'antibiotico ampicillina, che ha inibito la crescita batterica di questo ceppo, mentre nella rispettiva piastra con i batteri +pGLO si è verificata una resistenza all'antibiotico amp. a causa dell'introduzione del plasmide che ha portato ad una trasformazione genica, con la produzione di proteine che hanno portato a tale caratteristica. Riprendendo ciò che abbiamo avuto modo di osservare si è notato come, al contrario delle ipotesi, non ci fosse alcuna forma di bioluminescenza in alcuna delle 4 piastre, era infatti previsto che nella piastra contenente LB+amp+ara (+pGLO) si sarebbe notata una fluorescenza sotto i raggi UV; la nostra ipotesi della mancanza di questa caratteristica è che i btteri abbiano consumato tutto l'arabinosio contenuto nel terreno, la bioluminescenza in questi batteri è infatti causata dalla combinazione di un determinato plasmide e d un ambiente tale da potere attivare i geni dei batteri trasformati, in questo caso proprio l'arabinosio. Come verifica di questa ipotesi si può notare come nella microperovetta contenente il plasmide non ci fosse alcuna bioluminescenza sotto i raggi UV confermando ciò che abbiamo precedentemente affermato
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conclusioni
Altre piastre contenenti LB+amp+ara (+pGLO) presentavano un grado di bioluminescenza differente, in alcune infatti era facilmente osservabile in molte colonie, in altre invece era possibile notarla in misura minore.Come detto prima alla base di questa diversità c'è molto probabilmente la diversa concentrazione di arabinosio nelle piastre, che comporta quindi ad un attivazione maggiore o minore dei geni legati alla bioluminescenza
La foto rappresenta una delle piastre dopo qualche ora dall'incubazione, e si vede facilmente come almeno all'inizio in ogni piastra ci fosse un elevato livello di fluorescenza.A maggior ragione possiamo dire come l'arabinosio nei giorni a seguire sia stato impiegato nelle attività metaboliche dei batteri, portando quindi le piastre ad una dimunizione diminuzione generale dello zucchero e di conseguenza dell'intensità della bioluminescenza
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