1 SPE TP PCR

Test PCR : amplifier l'ADN pour identifier la présence d'un antigène

TP : comprendre l'utilisation de la technique PCR dans le dépistage du COVID-19

M.Mayans-Lycée beaussier-La Seyne sur mer

situation

covid -19, un corona virus

Plus d'infos

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Différents tests ont été mis au point pour dépister une contamination au SRAS-CoV-2

Détecter l'Antigène : test antigénique

Détecter les anticorps spécifiques : test sérologique

Détecter le matériel génétique du virus en l'amplifiant : test PCR

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le principe de la PCR

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le problème

Afin de bien comprendre le principe de la PCR on cherche à montrer l'importance des amorces choisies et du nombre de cycles effectués

Proposez une solution pratique afin de résoudre ce problème

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matériel disponible

matériel pour électrophorèse

MIX (Nucléotides + TAQpolymérase) 10µLAmorces (AB ou CD) 10 µL ADN 4µL

micropipettes (4µl et 10 µL )

microtubes

Protocole

thermocycleur

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je regarde bien la VIDEO et je m'entraîne virtuellement, (vous pouvez déplacer les objets . Merci à "SVT TURLAN")

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• mettez en œuvre le protocole
• consulter les résultats secours
• présentez-les,
• interpréter
• conclure

Résultats secours

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Les amorces : elles sont fondamentales puisqu'elles déterminent le fragment qui sera amplifié : Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier. Utiliser des amorces différentes permet d'amplifier des séquences différentes

Interpréter une électrophorèse de l'ADN : L'ADN est chargé négativement et migre vers la cathode en fonction de son poids moléculaire et donc de son nombre de nucléotides, de sa longueur

le nombre de cycles : On qualifie de valeur de cycle seuil ou de valeur Ct le nombre de cycles d’amplification requis pour générer suffisamment de copies d’ARN viral pour que celui-ci puisse être détecté.

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Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle :

• en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle)
• et elles servent d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).

Les oligonucléotides amorces s’hybrident aux extrémités de la séquence qui va être amplifiée, il faut donc connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région ADN amplifiée. C'est en effet au niveau de ces extrémités que les oligonucléotides amorces vont s'hybrider.

les nucléotides (A, T, C, G) servent d'éléments à la fabrication des brins d'ADN complémentaires

En théorie, le nombre de copies augmente de façon exponentielle à chaque cycle,

Si l’on suit la fluorescence au cours du temps d’une PCR en temps réel, on observe une augmentation de cette fluorescence et donc du nombre de fragments PCR en 3 phases distinctes : - Phase de bruit de fond : La quantité de fragments amplifiés est insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond (et donc la fluorescence générée). - Phase exponentielle: La quantité de fragments amplifiés génère un signal fluorescent supérieur au seuil de détection de l’appareil, puis le nombre de produits amplifié double à chaque cycle. - Phase de plateau (ou de saturation) : certains composants de la réaction (et en particulier le nombre de molécules de Taq disponibles) deviennent limitants.

La pandémie de COVID-19 qui a touché les humains en 2019 est une maladie à coronavirus due au virus SARS-CoV-2. Les coronavirus forment une vaste famille de virus présents chez l’homme et chez l’animal. Ils possèdent un génome à ARN extrêmement long (plusieurs milliers de nucléotides), et sont entourés d’une capsule de protéines en forme de couronne qui leur valent leur nom. Il existe de nombreux sous-types de coronavirus infectant différentes espèces animales. L’Homme peut en héberger au moins sept. Sur le plan médical, on distingue deux groupes de coronavirus qui touchent l’être humain :

• les coronavirus peu pathogènes (on en dénombre quatre actuellement). Les coronavirus peu pathogènes circulent en France chaque année, à l’automne, pendant tout l’hiver et au printemps, mais disparaissent pendant l’été. Très répandus, ces virus sont associés à des rhumes et des syndromes grippaux bénins. Ils peuvent également infecter l’Homme sans déclencher de symptômes ou, à l’inverse, être impliqués dans des complications respiratoires de type pneumonie chez des personnes immunodéprimées ou des nourrissons.
• les coronavirus hautement pathogènes, dont on ne connaissait que deux représentants : le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et le Coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV).En 2003, le SRAS avait infecté environ 8000 individus, causant la mort de 800 personnes dans le monde.

Ces virus se transmettent facilement d’homme à homme par voie aérienne, au contact de sécrétions ou à celui d’objets contaminés, particulièrement en période hivernale. La période d’incubation qui précède l’apparition des symptômes dure 3 à 6 jours et les traitements, s’ils sont nécessaires, sont symptomatiques (traitement de la fièvre, des congestions ou des douleurs éventuelles).

Le CNRS a développé deux tests RT-PCR, respectivement IP2 et IP4, dans le cadre de l’épidémie de Covid-19. Ces deux tests utilisent chacun trois séquences distinctes du génome du SARS-CoV-2. Le génome complet du SRAS-CoV-2 comprend un enchaînement de 30 000 bases, et celui du génome humain, 3 milliards. Comme le code génétique ne comporte que 4 bases (A, T, C, G), il arrive parfois que de petites séquences de nucléotides se retrouvent dans différents organismes, comme c’est le cas pour la séquence « CTCCCTTTGTTGTGTTGT ».

En effet, l’homme mais aussi d’autres espèces animales comme le labrador retriever, le chat, le cochon… possèdent cette séquence dans leur génome. Par contre, l’association des trois séquences est unique au SARS-CoV-2 et c’est cette singularité qui permet l’identification du virus dans les tests. ​

Plus la quantité d’ARN dans l’échantillon du patient est grande, moins il faut effectuer de cycles pour que le signal soit détectable (la valeur Ct est alors dite « faible »). En contrepartie, si l’échantillon clinique contient peu d’ARN, un plus grand nombre de cycles est requis. Une valeur Ct faible correspond donc à une charge virale élevée, alors qu’une valeur Ct élevée correspond à une charge virale faible.