Influenza Inès

Virus Influenza

Gras Arielle Serrhini Inès Yuksel Kubra Gundogan Emine

Objectifs

Comprendre :

• L'organisation du génome des virus Influenza A

• Le rôle du porc en tant qu’intermédiaire dans la transmission aviaire - homme

• Le rôle des protéines virales dans la transmission du virus

• Le rôle du résidus 627 de PB2 en tant que déterminant d’hôtes

Sommaire

Généralités

Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

Sommaire

Généralités

Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

Généralités

• Influenza virus

• Famille : Orthomixoviridae

--> 4 genres dont Influenza A

• ARN - simple brin

• Réplication dans le noyau

• Virus enveloppé

• Symétrie hélicoïdale

• Génome segmenté : 8 segments

Image provenant du cours de Mme Biquand

Génome des SIV:

• Comme Influenza A : génome segmenté

• 8 segments d'ARN - uniques monocaténaires

• Les segments 1,3,4,5,6 : codent pour les protéines virales ( PB2, PA, HA, NP et NA)

• Segments 7 et 8 : produisent deux ARNm codant chacun pour 2 protéines (M1, M2; NS1, NEP)

• Segment 2 : code pour la protéine PB1

Généralités

• Influenza A chez le porc

• Virus Influenza porcins : SIV (Swine Influenza Virus)

• Porc : hôte intermédiaire pour l’apparition de virus influenza réassortants à potentiel zoonotique.

Image provenant du cours de Mme Biquand

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Sommaire

Généralités

Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

Le porc, un hôte important du virus Influenza

• Le porc permet l'émergeance de "nouvelles" souches virales : réassortiment génétique

• Sous-types devenus enzootiques chez le porc

Image provenant du cours de Mme Biquand

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• Exemple du sous-type réassortant H1N1 responsable de la pandémie de 2009

• Réassortiment sur HA, NA --> cassure antigénique --> nouveau sous-type

Image provenant du cours de Mme Biquand

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Le porc et la transmission inter-espèce du virus Influenza A

• Oiseaux aquatiques sauvages : réservoir de la diversité génétique des virus Influenza

• Virus aviaire --> mammifères --> adaptation à l'Homme (porcs, chevaux...)

• Porc : peut-être contaminé par le virus aviaire, humain etc... et peut contaminer ces derniers par les SIV!

Image provenant du cours de Mme Biquand

Historique des pandémies dues au virus Influenza et l'influence du porc

• 1918 : grippe espagnol, pandémie H1N1.

• 1957 : grippe asiatique, pandémie H2N2.

• 1980 : le porc est considéré important dans la génération d’un virus à potentiel pandémique, car chez le porc on a retrouvé à la fois des récepteurs pour virus aviaires et des récepteurs pour virus humains.

• Depuis 1997 : infections humaines par des virus aviaires H5, H7 et H9 sans intervention d’hôte intermédiaire.

Remise en question concernant le rôle du porc dans la transmission du virus

Image provenant du cours de Mme Biquand

Sommaire

Généralités

Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

Le porc et son rôle dans la transmission

• 2009 : pandémie H1N1 relance le débat : chaque segment génomique de ce virus provient de virus Influenza A préalablement adapté au porc!

Le porc et son rôle dans la transmission

Formation du nouveau réassortant, H1N1, à l'origine de la pandémie de 2009 :

Provient de 3 réassortiments successifs :

• North American swine H3N2
• North American swine H1N2
• Nouveau H1N1 ou pH1N1/09

Le porc et son rôle dans la transmission

HA : hémagglutinine

• glycoprotéine antigénique virale
• fixation de la particule virale à un récepteur situé sur la cellule cible

NA : neuraminidase

• glycoprotéine antigénique virale
• activité sialidase
• limiter l'agrégation des particules virales
• faciliter la diffusion des virions dans le mucus

Le porc et son rôle dans la transmission

HA : hémagglutinine

• glycoprotéine antigénique virale
• fixation de la particule virale à un récepteur situé sur la cellule cible

NA : neuraminidase

• glycoprotéine antigénique virale
• activité sialidase
• limiter l'agrégation des particules virales
• faciliter la diffusion des virions dans le mucus

Image provenant du cours de Mme Biquand

Le porc et son rôle dans la transmission

2 types d'acides sialique :

• Acide N-acétylneuraminique
• Acide N-glycolylneuraminique

Récepteurs :

• Homme = AS𝞪2,6Gal
• Oiseaux = AS𝞪2,3Gal

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Le porc et son rôle dans la transmission

Chez les porcs on a les deux acides sialiques :

• l’ Acide N-acétylneuraminique

• l’Acide N-glycolylneuraminique

Qui vont former les récepteurs :

• AS 𝞪2,3Gal

• AS 𝞪2,6Gal

Donc il y’a une plus grande diversité virale qui peut se créer. = c’est donc un très bon intermédiaire à la formation de réassortants aviaires/humains.

Le porc et son rôle dans la transmission

Chez le porc:

• L'AS 𝞪2,6Gal se trouve au niveau du tractus respiratoire supérieur

• L'AS 𝞪2,3Gal se trouve au niveau des zones subépithéliales de ces régions

Ces derniers récepteurs sont prédominants à la surface des cellules pulmonaires.

Le porc et son rôle dans la transmission

Préférence pour les AS𝞪2,6Gal, ce qui favoriserait la transmission à l’homme.

Certains SIV tels que Eurasian avian-like swine H1N1 possédant une HA de type aviaire ont maintenu une affinité pour les AS 𝞪2,3Gal.

SIV

Les chercheurs ont alors supposé que le porc représente le siège de la formation des réassortants et permet la transmission des virus influenza aviaires chez l’homme.

Le porc et son rôle dans la transmission

-Les deux types viraux, aviaire d’un côté et porcin d’origine aviaire de l’autre, se multiplient de façon identique dans les cellules pulmonaires du porc. -Permet la coexpression de plusieurs types de récepteurs, et donc présenter une prédisposition à la co-infection et à la génération des réassortants.

Le porc et son rôle dans la transmission

PB2 est un déterminant de la sensibilité des complexes polymérases à la température : si nous voulons que le virus puisse se répliquer, - Chez le porc : 36-37 degrés - Chez l’oiseau : 37-40 degrés - Chez l’homme : 33 degrés

Image provenant du cours de Mme Biquand

- PB2 est un déterminant qui diffère entre virus aviaires et virus humains, par la nature de son acide aminé 627. -PB2 est aussi connu comme déterminant de l’efficacité de la transcription et la réplication des virus influenza A dans les cellules de mammifères.

Le porc et son rôle dans la transmission

Le porc, permet alors l’adaptation de virus aviaires aux mammifères et l’échange de matériel génétique entre virus de lignage différents conduisant à la formation de nouveaux virus réassortants. Il joue donc un rôle important dans la génération de virus potentiellement pandémique.

Sommaire

Généralités

Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

Analyse : La réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

• les virus humains d' Influenza A se répliquent dans les voies respiratoires supérieures à 33°C et induit une maladie respiratoire aiguë.

• Les virus aviaires se répliquent dans le tractus intestinal à 41°C

Étude de la réplication du virus Influenza A chez l’Homme, en comparaison avec le virus aviaire à différentes températures afin de comprendre :

Dans quelles conditions se déroule sa réplication chez l’Homme et les oiseaux aquatiques sauvages ?

1ère Partie

Dépendance à la température de la multiplication des virus de la grippe aviaire et humaine

La dépendance naturelle à la température des virus Influenza A pourrait - elle contribuer à la spécificité de leur hôte ?

-Comparaison des capacités des virus de la grippe A humaine et aviaire à se répliquer à la température des voies respiratoires supérieure à 33 °C.

-Culture à 35 °C dans des œufs de poule embryonnés âgés de 11 jours

• de virus aviares :
• MAL ; FPV ; PIN

• de virus humains :
• PR8 ; BAY ; SYD

-Des dosages de plaque ont été effectués avec les fluides allantoïdiens sur les cellules MDCK à 33° ou 37° en parallèle.Les titres de virus et la taille de la plaque étaient examiné à 72 h après l’infection pour le MAL, PIN, BAY, et SYD et à 96 h post infection pour les virus FPV et PR8.

-Pour les virus humains : les titres étaient similaires, qu’ils soient mesurés à 37 ou 33°C. -Pour les virus aviaires MAL, FPV et PIN, les titres semblaient être plus bas à 33°C qu’à 37°C. -La taille de la plaque n’a été que légèrement réduite à 33°C par rapport à 37 °C pour les virus humains, mais a été fortement réduite pour les virus aviaires.

L'efficacité de la multiplication des virus aviaires est-il altérée à 33 °C ?

-Infection des cellules MDCK et COS-1 par les virus à une multiplicité d'infection (MOI) de 20 et 10 UFP/cellule, respectivement. -Adsorption, lavage et incubation avec un milieu chauffé à 37 ou 33°C. -Extraction des ARN totaux à différents moments après l’infection. -Transfert sur membrane de nylon et insertion d'une ribosonde radiomarquée 32P dirigée contre le segment nucléoprotéique (NP).

Pour les cellules MDCK et COS-1 : La réplication des virus PR8 et SYD sont similaires à 37 et 33°C. En revanche, la réplication des virus MAL, FPV et PIN semblait retardée à 33°C par rapport à 37°C.

La spécificité des virus Influenza A pour leurs hôtes dépend de la température.

En revanche, il n'est pas température dépendant pour l’hôte humain.

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Généralités

Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

2ème Partie

Dépendance à la température du complexe polymérase des virus de la grippe aviaire et humaine

La faible efficacité de la multiplication virale observée à 33 °C pour la MAL(aviaire) et le FPV(aviaire) est t-il liée à un défaut de transcription et / ou de réplication des segments d’ARN viral ?

Les monocouches subconfluentes des cellules COS-1 ont été transfectées avec quatre plasmides codant pour les protéines : - PB1 : dérivé de la souche PR8(humain) - PB2 : dérivé de la souche MAL(aviaire) - PA : dérivé de la souche FPV(aviaire) - NP : dérivé de la souche humaine A/Victoria/3/75 (VIC)(humain) - ainsi que de 1 mg du plasmide pPolICAT-RT, qui entraîne l’expression d’un virus semblable à un virus ARN rapporteur de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT).

-Ceci indique que les efficacités avec lesquelles les complexes polymérases ont assuré la transcription et la réplication pour les virus humains n’avait pas de différence significative, avec les deux températures-En revanche elles étaient réduites de près de 10 à 100 fois - à 33 °C pour les virus aviaires.

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Généralités

Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

3ème Partie

Identification du résidu 627 de PB2 comme déterminant majeur de la sensibilité au froid du complexe polymérase dans les cellules COS-1

La sensibilité au froid peut-il être attribuée à l’une ou l’autre des protéines : PB1, PB2, PA et NP impliquées dans la transcription et la réplication de l’ARN viral ?

Les protéines PB1, PB2, PA et NP dérivées du FPV ont chacune été testées en combinaison avec les trois autres protéines dérivées de PR8 à 37 et 33°C.

Ces observations suggèrent que les protéines responsables de la sensibilité au froid des complexes de transcription-réplication dérivés de virus aviaires étaient principalement PB2 et dans une moindre mesure PA.

Utilisation de plasmides exprimant la protéine mutante PB2 de la souche FPV ou MAL, en modifiant l'acide glutamique par une lysine en position 627. (protéines E627K-PB2).

Cela a permis d’identifier le résidu 627 de PB2 comme un déterminant majeur de la sensibilité au froid de l’activité de transcription-réplication du complexe polymérase.

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Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

4ème Partie

Influence du résidu 627 de PB2 sur l’activité du complexe polymérase dans les cellules aviaires

Les cellules COS-1 (A) ou les cellules QT6 (B), transfectées avec pT7- CAT-RT et quatre plasmides exprimant les protéines PB1, PB2, PA et NP dérivées des virus VIC ou MAL.

Qu’elle est l’influence du résidu 627 de PB2 sur l’activité des complexes polymérases reconstitués dans les cellules aviaires QT6 ?

Ces données ont indiqué que dans les cellules QT6, contrairement à ce qui a été observé dans les cellules COS-1, le résidu 627 de PB2 n’était pas un déterminant de l’activité de transcription-réplication du complexe MAL à 37 ou 33 °C.

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Généralités

Influenza virus: hôtes importants, SIV, transmission inter-espèce

LE RÔLE DU PORC DANS LE MÉCANISME DE TRANSMISSION DU VIRUS

Analyse: la réplication de l'ARN des virus de la grippe aviaire et la sensibilité au froid

Multiplication du virus et température

Complexe polymérase et température

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules humaines

Résidus 627 de PB2 et température sur cellules aviaires

Transcription/réplication ARN viral et température

5ème Partie

Dépendance à la température de la transcription et/ou de la réplication de l’ARN viral des virus de la grippe aviaire et humaine.

La sensibilité au froid liée aux protéines PB2 d’origine aviaire est t-il liée à la transcription et/ou à la réplication ?

-Les cellules COS-1 ont été transfectées avec des plasmides exprimant des protéines de base dérivées de PR8 ou de MAL, ainsi que pPolI-CAT-RT. Après 48 heures d’incubation à 37 °C (voies 1 à 6) ou 33 °C (voies 7 à 12), les ARN totaux ont été extraits et analysés par test de protection de la RNase.

Analyse: -C- : contrôle négatif donc les auteurs ont déposé 5µg d'ARNt de levure -C+ : le plasmide non digéré avec une taille connue et surtout de l'ARN viral -Voies 1 et 7 : avec des cellules COS-1 transfectées avec pPolI-CAT-RT sans plasmides d’expression protéique -Voies 2 et 8 : des cellules COS-1 et des plasmides d’expression protéique PR8 sans pPolI-CAT-RT -Voies 3 et 9 : des cellules COS-1 -Voies 4 et 10 : cellules COS-1 ont été cotransfectées avec pPolI-CAT-RT et les plasmides d’expression PB1, PB2, PA et NP dérivés de PR8 (humain). -Voies 5 et 11 : cellules COS-1 ont été cotransfectées avec pPolI-CAT-RT et les plasmides d’expression PB1, PB2, PA et NP dérivés de MAL avec PB2 de type sauvage -Voies 6 et 12 : cellules COS-1 ont été cotransfectées avec pPolI-CAT-RT le plasmide d’expression mutant MAL E627K-PB2

-Résultats voies 4 et 10 : Cela a confirmé que ni la réplication ni l’activité de transcription du complexe dérivé de PR8 n’étaient altérées à 33 ° C

-Résultats voies 5 et 11 : Ces observations suggèrent que les activités de réplication et de transcription du complexe MAL étaient altérées dans les cellules COS-1. Cependant, les très faibles niveaux d’ARNc dans les cellules exprimant les protéines dérivées de la MAL à 37 ° C ainsi qu’à 33 ° C n’ont pas permis une quantification fiable, et donc la question de l’implication de la transcription et / ou de la réplication dans la sensibilité au froid du complexe dérivé aviaire n’a pas pu être abordée.

-Résultats voies 6 et 12 : Ces données suggèrent que les activités de réplication et de transcription du complexe MAL ont été améliorées avec E627K-PB2 par rapport à la protéine PB2 de type sauvage. Ces observations favorisent une implication de PB2 dans la réplication.

Conclusion

Le résidu 627 de PB2 (une Lysine dans toutes les protéines d’origine humaine et un acide Glutamique dans toutes les protéines d’origine aviaire) est un déterminant de la sensibilité naturelle au froid des complexes polymérases dérivés d’oiseaux lorsqu’ils sont reconstitués dans les cellules COS-1. Tandis que la nature du résidu 627 de PB2 ne semblait pas critique en ce qui concerne l’activité des complexes polymérases reconstitués dans des cellules aviaires .

Fait intéressant

Le résidu 627 de PB2 différait parmi les virus aviaires H5N1 responsables de maladies respiratoires chez les humains à Hong Kong en 1997. La substitution de Glu627Lys dans PB2, en association avec d’autres déterminants moléculaires, aurait pu contribuer à une efficacité réplicative et pathogénicité accrues des virus H5N1 chez l’homme.

Merci pour votre attention!