DOSSIER VECTORES

Evidencia 1.

Dosier de vectores virales y no virales.

B A R B A R A

C A M A C H O

2023

01 Fosfato de Calcio

02 Microinyección

03 Biobalistica

04 Inyeccion intravascular hidrodinamica

05 Sonoporación

Índice

06 Magnetofección

07 DNA desnudo

08 Liposomas

09 Polimeros

10 Dendrimeros

11 Vector retroviral

12 Vector adenoviral

13 Vector adenoviral asociado

Vectores No Virales

01 Fosfato de Calcio

Fosfato de Calcio

La utilización del fosfato de calcio se basa en lacapacidad que presentan los iones calcio para precipitar el ADN provocando que la célula, mediante endocitosis, introduzca el ADN en su interior

Desventajas

Ventajas

• No provoca toxicidad en las células

• Su eficacia de transfección es solo del 10%• Solo se usa en cultivos celulares en aplicaciones ex vivo

02 Microinyección

Microinyección

El ADN es introducido por inyección directamente en el núcleo de las célula de interés, gracias a la ayuda de un micro manipulador, evitando de este modo la degradación citoplasmática y lisosomal.

Desventajas

Ventajas

• Alta eficacia de expresión • Estables ex vivo, in vivo (DNA desnudo)

• Necesita células ailadas• Daño en células al momento de inserción

03 Biobalística

Biobalística

El plásmido de ADN que trasferirá es situado sobre la superficie de pequeñas gotas de 1 a 3 micras de diámetro, principalmente de oro o tungsteno, que posteriormente son “disparadas” mediante una descarga eléctrica o un pulso de gas, hacia la célula diana.

Desventajas

Ventajas

• Fácil manejo • Único disparo con integración múltiple

• Muerte celular • Grandes variaciones en la eficacia de expresión de genes

Microproyectiles

Método efectivo de transferir genes en modelos tanto in vitro como in vivo. La expresión conseguida suele ser transitoria y con una frecuencia relativamente baja, cercana a 10­4, tan sólo se logra la integración efectiva en el genoma 10-8 de las células expuestas, lo que hace que se requieran grandes dosis para alcanzar el éxito.

Desventajas

Ventajas

• Potencial de aplicabilidad general
• Fácil manejo
• Un único disparo puede producir integraciones múltiples.

• Muerte celular
• Dependiendo de la rigidez de los tejidos, la procedencia del ADN extraño y la capacidad de transcripción intrínseca aparecen grandes variaciones en la eficiencia de la expresión de los genes.

Electroporación

Aplicación de una corriente eléctrica a células, capaz de abrir poros en la membrana celular que permite la entrada del gen en su interior.

Desventajas

Ventajas

• Célula aislada del organismo • Control de calidad

• Muchas células mueren por el choque eléctrico

04 Inyección intravascular hidrodinamica

Inyección intravascular hidrodinamica

Método que puede administrar ácidos nucleicos a través del torrente sanguíneo a las células y tejidos circundantes. Es más eficaz para la administración in vivo al hígado, donde es una herramienta única para los estudios de identificación y validación de objetivos

Desventajas

Ventajas

• Incremento en la presión hidrostática • Forma poros o microdefectos en la membrana • Se utiliza in vivo (hígado, músculo y corazón)

• Retención dentro de vasos sanguíneos hasta que se degraden y se filtren fuera del cuerpo.

05 Sonoporación

Sonoporación

Transformación celular potenciada por ultrasonidos. Cuando se aplican ultrasonidos de baja frecuencia (unos 20 kHz) a suspensiones celulares, los efectos de la cavitación acústica provocan una permeabilización transitoria de la membrana en los tejidos celulares.

Desventajas

Ventajas

• Incrementa la permeabilidad
• Se usa en paredes vasculares, corazón y músculo

• Baja eficacia
• Transitoria

06 Magnetofección

Magnetofección

Método de transfección que utiliza la química de las nanopartículas cationicas magnéticas y campos magnéticos para concentrar partículas que contienen ácido nucleico y asi ser inducida. Las nanoparticulas suelen ser de hierro y se recomienda el uso de microproyectiles

Desventajas

Ventajas

• Trasfección en pocos minutos
• Muy eficiente (>90% en la teoría)

• Toxicidad

07 DNA desnudo

DNA desnudo

Inyección directa de la parte codificadora a un tejido. El ADN es vehiculizado en una solución salina o sérica y normalmente administrado mediante inyección intramuscular. Esta técnica presenta un porcentaje bajo de transfección y no se logra la integración en el genoma. Se utiliza en la terapia génica in vivo, aunque la persistencia de la expresión de genes son probablemente demasiado cortos (días).

Ventajas

Desventajas

• Método directo y simple
• Económico
• Baja toxicidad

• El mecanismo por el que entra en la célula diana permanece siendo un enigma.
• Eficacia baja o nula

08 Liposoma

Liposoma

Los liposomas catiónicos interaccionan tanto con el material genético a transferir como con las membranas celulares que deben atravesar, debido a la presencia de cargas netas negativas originadas por los grupos fosfato en el ADN y por residuos del ácido siálico de la superficie celular.

Desventajas

Ventajas

• Su eficacia en modelos in vivo se ve disminuida llegando a ser nula

• No plantea problemas en modelos in vitro

Lipoplex Anionico

• La carga negativa del grupo polar de los lípidos aniónicos, impide su asociación con el DNA debido a la fuerza electrostática repulsiva que existe entre los grupos fosfato del DNA y el grupo aniónico del lípido. Sin embargo, es posible mitigar este efecto por el uso de cationes divalentes que anulan las repulsiones electrostáticas. Se encuentran naturalmente en las membranas celulares.

Desventajas

Ventajas

• Baja toxicidad
• Baja eficiencia de tranfección

• Biocompatibles

Lipoplex Neutro

Lípidos zwiteriónicos se caracterizan por presentar carga positiva y negativa en la misma molécula, siendo, por tanto, el pH del medio el que determina la carga neta global. Habitualmente, se utilizan mezclados en distintas proporciones con el lípido catiónico a un pH tal que su carga neta sea nula.

Desventajas

Ventajas

• Presentan interacciones desfavorables con las proteínas de la sangre.
• No presentan especificad a nivel celular.
• En ensayos in vivo presentan problemas de difusión en el organismo.

• Eficientes vectores de transfección

Lipoplex Cationico

Formados por lípidos que presentan una carga positiva en sus grupos polares, de tal forma que la carga superficial del liposoma es positiva. Esta característica favorece la interacción electrostática espontánea con las cargas negativas de los grupos fosfato del DNA, es decir la formación del lipoplejo. Al mismo tiempo, la carga favorece la interacción con los componentes negativos de las membranas celulares en la captación celular. Además, protege al DNA de la degradación por las enzimas DNAasas.

Ventajas

Desventajas

• Lípidos con espaciadores flexibles, cortos o hidrofílicos

• Eficiencias de transfección

• Presentan espaciadores rígidos, muy largos, o hidrofóbicos

• No favorecen la transfección
• Presentan niveles altos de citotoxicidad.

Inmunoliposoma

Se incorporan anticuerpos monoclonales que les permiten dirigirse a células concretas o de los virosomas, que incluyen proteínas o péptidos endosomolíticos que bloquean la degradación lisosomal del DNA aumentando la cantidad de este que puede alcanzar el núcleo celular

Desventajas

Ventajas

• El núcleo celular alcanza a tener una mayor cantidad de DNA

• No es muy eficaz en modelos in vivo

09 Polimeros

Polimeros

• Moléculas (generalmente orgánicas) formadas por la unión de moléculas más pequeñas llamadas monómeros. Las modificaciones de vectores poliméricos han mostrado exitosos avances para obtener una liberación específica en un tejido particular y en promover la eficiencia en la transferencia genética intracelular.

Desventajas

Ventajas

Con PEG: • No permite que se formen los agregados de liposomas • Aumenta el tiempo en que permanece el liposoma • Mejora la distribución • Previene la captura por MPS

• Biocompatibilidad
• Solubilidad en medios acuosos y orgánicos
• Poca inmunogenicidad y antigenicidad
• Baja toxicidad

10 Dendrimeros

Dendrimeros

Es una macromolécula polimérica compuesta de múltiples brazos monoméricos. El número de brazos va incrementado y se mueven del centro a la superficie y define la generación del dendrimer. Tienen un solo peso molecular

Desventajas

Ventajas

• Ofrecen una robusta construcción covalente
• Extremo control en la estructura y tamaño
• Toxicidad baja in vitro y in vivo

• Entre mayor tamaño molecular, mayor toxicidad

Vectores Virales

11 Retrovirus

Retrovirus

Se remplazan las regiones codificadoras para las proteínas estructurales gag, pol y env por el gen o genes de interés, lo que permite la incorporación de cADN de hasta 8 kb.

Ventajas

Desventajas

• Integración estable
• Fácil manejo
• No provocan respuesta inmune

• Transducción eficiente

• Bajo título
• Posible mutación insercional
• Extinción del transgén in vivo
• Requieren proliferación celular

Gammaretrovirus

Se conocen como oncoretrovirus. Estos virus se identificaron históricamente por sus propiedades inductoras de leucemia y se han aislado de varias especies

Desventajas

Ventajas

• Infecciones por recombinación de virus
• La capacidad del tamaño
• Solo para uso ex vivo /si hay estrategias para uso in vivo/
• Mutagenesis en sitios pro-oncogénicos

• Uso simple
• Alta eficacia de transfección
• Integración al genoma
• Expresión permanente /meses

Lentivirus

Derivados del retrovirus de ARN monocatenario VIH-1, se han utilizado ampliamente como herramientas de transferencia de genes en el SNC debido a su capacidad para infectar células que no se dividen, integrarse eficientemente en el genoma del huésped, transportar transgenes grandes y permitir una transmisión estable.

Ventajas

Desventajas

• Generación de virus competentes ya sea en la preparación en la recombinación, in vivo
• Mutagénesis

• Trasfecta células no en división
• Uso in vivo

12 Adenovirus

Adenovirus

Requieren de un sistema de complementación que es la línea celular HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) modificada para que produzca constitutivamente los elementos E1.

Desventajas

Ventajas

• Células en reposo o replicación
• Episomales
• Estables in vivo
• Títulos altos

• Respuesta inmune e inflamatoria
• Direccionalidad difícil
• Difícil manejo

Adenovirus 1era Generación

Son removidos los cassettes E1 y/o E3, usan promoto y sitio de poliadenilación. ITR, señal de empaquetamiento, se deleta E1 y se insertan hasta 5.1 kb de promotor, secuencia de interés y poly A, si se quiere más espacio se deleta E3 y da hasta 8kb. E2 y E4 se dejan, al igual que los genes tardíos

Desventajas

Ventajas

• Permite la introducción de 5.1kb de DNA, si solo se remueve E1 y si es deletado E1 y E3 hasta 8kb

• Replicacion deficiente in vivo
• Fuerte respuesta inmune e inflamatoria

Adenovirus 2da Generación

Remoción del cassette E2 y E4. Pueden ya empacar hasta 14kb de DNA foráneo. ITR, señal de empaquetamiento, deleción E1, E2, E3 y E4. Se dejan genes tardíos. En transgén va promotor, secuencia de interés y PolyA.

Desventajas

Ventajas

• Aumenta capacidad de replicación
• Menor respuesta inmune

• Menor eficacia de trasfección

Adenovirus 3era Generación

Llamados “gutless” o “gutted”. Remoción de todos los genes virales, dejando solo los ITR y algunas Ψ. Se extiende el espacio hasta 37kb. DNA stuffer no tiene tanta relevancia, pero da estabilidad.

Desventajas

Ventajas

• Vectores de gran capacidad, puede contener un solo gen o múltiples genes

• Depende de un helper, que contenga lo necesario para su empaquetamiento

13 Adenovirus asociados

Adenovirus asosciados

Se necesita genoma del AAV recombinante que contiene el transgen, elementos reguladores (promotor y cola de poli A) y los ITRs los cuales serán clonados en un 7 plasmido.Tambien se necesitan los genes rep y cap del AAV de vida silvestre. Y por ultimo Los genes E2A, E4 y ARN VA del virus colaborador, necesarios para la replicación viral, además de una línea celular que provee la maquinaria básica de biosíntesis.

Desventajas

Ventajas

• Células en reposo o replicación
• Posible Integración específica
• Poco inmunogénicos
• Títulos altos
• No son patogenos en himanos

• Poca longitud de transgén
• Difícil de producir en gran cantidad
• No parecen transducir a todo tipo de células in vivo
• Posible mutación insercional.

Referencias

• Juana Rozalén, Valentín Ceña, Joaquín Jordán (2003) Terapia génica. Vectores de expresión. Centro Regional de Investigaciones Biomédicas. Universidad de Castilla-La Mancha. ELSERVIER. https://www.elsevier.es/es-revista-offarm-4-articulo-terapia-genica-vectores-expresion-13051502
• Mauro Giaca (2010), Gene Therapy. International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) Trieste, Italy
• Mazzolino G., Ruiz J, Qian C. & Prieto J. (2001). La terapia génica: susaportaciones a las enfermedades hepáticas y renales. Nefrología, 21, 17-23

B A R B A R A

C A M A C H O

Barbara Melissa Camacho Cruz 1594149