DOSSIER VECTORES VIRALES Y NO VIRALES

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS LICENCIADO EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA UA: TERAPIA GÉNICA Dra. Brenda González Hernández Dossier: "Vectores Virales y Vectores No Virales" Gpo:483 Equipo: Sánchez Méndez Yessica Magali 1869013 Hinojosa Guajardo Homero 1738250 Ileana Gabriela Berlanga Vallejo 1661875

2023

1 Vectores No virales

1.1 Químicos

1.1.1 Fosfato de Calcio

1.2 Fisicos

1.2.1 Biobalística

1.2.2 Microinyección

1.3 Fusión

1.3.1 Liposomas

Índice

1.3.2 Polimeros

1.4 Endocitosis

1.4.1 Dendrímeros

1.4.2 Inmunoliposomas

1.4.3 Mediados por receptor

2 Vectores Virales

2.1 Retrovirus

2.1.1 Lentivirus

2.1.2 Gammaretrovirus

2.2 Adenovirus

2.3 Adenovirus Asociados

01 Vectores No virales

1.1 Químicos1.1.1 Fosfato de calcio

Producción

1. Se prepara un buffer de fosfato
2. El DNA o RNA se mezcla en una solución de NaCl
3. Por combinación de cargas se precipta

Consiste en la capacidad presente en los iones calcio para precipitar el DNA haciendo que la célula, por medio de endocitosis, lleve el DNA a su interior. Ventajas

• No presenta toxicidad en las células.
• Técnica dácil y económica

Desventajas

• Presenta una expresión del transgén transitoria.
• Tiene una eficacia de transfección cercana al 10%.
• Solo se puede usar en cultivos celulares y solo es ex vivo.

Para que la transfección sea satisfactoria se debe controlar el tamaño del precipitado. Se debe tomar en cuenta factores como pH, temperatura y la forma de mezclado del buffer salino y la solución de ADN.

Herramienta de biobalisticaPistola de Genes de Baja Presión: Helios ® Gene Gun System (BioRad®) -utiliza helio como gas para disparar las partículas de oro. Número de disparos: 1, 2. Tamaños de partícula de oro: 0.6 y 1.6 µm de diámetro

Ventajas

Desventajas

1.2 FISICOS 1.2.1 Biobalistica

Eficacia variable y expresión transitoria Integración solo de 10-8 Produce muerte celular

Se usa in vitro e in vivo Fácil manejo Integraciones múltiples

Usos

Entre las aplicaciones del método de biobalística se encuentran la expresión transitoria de genes heterólogos de interés biotecnológico, estudio de vías metabólicas, transferencia de RNA viral y expresión estable en plantas transgénicas.

Bombardeo de micro-partículas de oro o tungsteno impulsadas a gran velocidad por liberación de He o N2 a gran presión. Utilizada para cultivos celulares Utiliza particulas de metales de 1um hasta 20um Penetran hasta 20 capas de células

• Protocolos de vacunación
• Transformación de células vegetales
• Creación de plantas transgénicas Monocotiledoneas y dicotiledoneas

1.2.2 Microinyección

Consiste en colocar el ADN mediante una inyección en el núcleo mediante un micromanipulador Se requieren células aisladas Se usa ex vivo

Producción La producción de este tipo de equipo es producida por la compañía Leica-Microsystems, ya que es la única que produce el equipo en conjunto, de lo contrario todas las piezas se adquieren de manera individual y posteriormente se realiza una construcción personalizada.

Utilización Organismos transgénicos Introducir RNA antisentido y DNA en la piel

Ventajas

• Alta eficacia de transfección
• Técnica más usada en invertebrados

Desventajas

• Técnica costosa
• Eficacia de integración génica del 30%
• Requiere equipo especializado y personal capacitado
• Manipulación y seguimiento individual de las células

White, K. E., Koller, D. L., & Corbin, T. (2014). Skeletal Genetics. Basic and Applied Bone Biology, 149-171. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-416015-6.00008-3

1.3 FUSIÓN1.3.1 Liposomas

Se constituyen de bolsas rodeadas de una membrana lipídica, similares a las células eucariotas animales.Se les puede introducir tanto drogas como DNAEl DNA se introduce en su centroAdquiere el nombre de lipoplex cuando se le introduce el DNA

Liposomas neutrosUso en constructos del lipoplexZwitterión (zwitterionic)Son compuestos neutralesPero tienen cargas positivas y negativas en átomos diferentes.

Desventajas Cristalización de lípido Cinéticas variables Baja solubilidad Menor eficacia de transfección

Ventajas Reduce la toxicidad de agentes encapsulados Liberación controlada Simple manufactura No presenta respuesta inmune No hay limitación en el tamaño del ácido nucleico a transportar

Producción Disolución de fosfolípidos en éter etílico mezclado con una fase acuosa volumen 1:3. Emulsificada por sonicación obtiene una suspensión de micelas invertidas.

Liposomas catiónicosForman complejos tanto con el material genético a transferir como con las membranas celulares a atravesar, ya que presentan cargas negativas por el grupo fosfato en el DNA y los residuos de ácido siálico de la superficie celular.Su porción lipídica se asocia con el DNASe forma una condensación entre las cargas negativas y positivasPresentan interacciones electrostáticas.Por una condensación controlada del DNA se permite la formación de partículas de 20-110 nm.Aumentan la estabilidad del lipoplex.Se evalúa la condensación con el potencial Z, que representa la unión entre el lípido y el DNA. Haciendo que la atracción sea proporcional a la condensación.

Tipos de liposomas

Liposomas aniónicosSirve para encapsular el DNA.Presentan una capacidad limitada para entrar al citosol (debido a la carga que posee LA-/-Membrana).Es un transportador de drogas sitio-específica.

1.3.2

Poli-L-Lisina

• Presenta una unión electrostática
• Siendo el DNA el polianión y la Poli-L-Lisina el policatión
• El poliplex se internaliza
• Presenta una eficiencia 3 veces mayor que un lípido catiónico, pero si se une a un lípido aumenta su efectividad 10 veces más por ser policationes conjugados
• Pueden hacerse específicos utilizando un promotor o receptor
• Usado en tejidos hepático, nervioso y pulmonar

Polímeros

Son macromoléculas (que son generalmente orgánicas) que se forman por la unión de moléculas más pequeñas a las que se les conoce como monómeros.La polimerización es la reacción en la que se sintetiza un polímero por medio de sus monómeros.

Biopolímeros

• Tipo de polímero que se produce en un organismo vivo
• Ej. péptidos, proteínas y polietileno
• También se les conoce como liposomas no-lípidos.
• Mismo principio que los liposomas.
• El complejo con DNA-polímero es conocido como poliplex.

• Son polímeros catiónicos
• Formándose por atracción de cargas.

• El poliplex no puede liberar el DNA en el interior del citoplasma
• Se debe co-transfectar con un agente que promueva en el endosoma la lisis.

Los polímeros más usados serían:

• El poli-etileno-glicol (PEG)
• Poli-L-lisina (PLL)

Se usan in vitro y se introducen de manera más eficiente en el DNA.

Poli-Etileno-Glicol

• Va asociado a un liposoma
• Es un polímero lineal
• Se le considera como un estabilizador esterico
• Se incorpora al liposoma por

1- Anclaje del polímero a membrana del liposoma mediante entrecruzamiento lipidico 2-Lipo-poliplexPropiedades y beneficios

• Biocompatibilidad (PEG)
• Baja toxicidad
• Poca inmunogenicidad y antigenicidad
• Solubilidad en medios tanto acuosos como orgánicos. (PEG)
• No deja que se formen los aglomerados de liposomas (PEG)
• Mejora la distribución (PEG)
• Aumenta el tiempo en que permanece el liposoma (PEG)

Construcción

1.4 ENDOCITOSIS1.4.1 Dendrímeros

Ruta divergente el dendrímero se construye del núcleo hacia la periferia partiendo de un núcleo multifuncional.

Ruta convergente el dendrímero se construye acoplando entidades dendriméricas en un núcleo multifuncional

Macromolécula polimérica compuesta de múltiples brazos monoméricos, son similares a las proteínas por lo tanto ofrecen un tipo de interacción con sistemas biológicos

Nanopartícula de materiales con estructura de árbol

Tiene un solo peso molecular

Ventajas

• Ofrecen una robusta construcción covalente
• Extremo control en la estructura y tamaño
• Toxicidad baja in vitro y in vivo
• Entre mayor tamaño molecular mayor toxicidad
• Pueden actuar de manera simultánea con múltiples receptores

Desventajas

• Dificultad de obtener dendrímeros de altas generaciones debido al impedimento estérico

Aplicaciones Pueden ser cargados de drogas o con marcadores radioactivos o químicos distintas

El número de brazos va incrementando y se mueven del entro a la superficie y define la generación de dendrimer Entre mayor sea el número de generación mayor es su eficacia

Mecanismo

1.4.3 Mediados por receptor

El ligando del poliplex reconoce los receptores celulares específicos

Es la conjugación de un ligando con el policatión Las células blanco tienen receptores de superficie acoplados a endocitosis

El poliplex es endocitado por el receptor

Desventajas Escape del lisosoma --Moléculas fusogénicas Es difícil llegar al núcleo Ventajas Entrada selectiva de moléculas en la célula Receptores confieren la característica de ser sitio-específico Tipos más comunes de endocitosis mediada por receptores: -Endocitosis mediada por clatrina -Endocitosis mediada por caveolina

Es introducido el gen

1.4.2 Inmunoliposomas

Variante de liposomas donde se insertan en la membrana anticuerpos los cuales tienen 2 funciones:Dirigir al liposoma al tejido Inducir la endocitosis

Producción Se emplea el método "Bangham" el cual consiste en la disolución de fosfolípidos en éter etílico mezclado con una fase acuosa volumen 1:3. Emulsificada por sonicación obteniendo una suspensión de micelas invertidas. A estos se les añade el anticuerpo de la zona que se desea tratar para hacerlo específico.

Objetivo– Hacerlo sitio-específico

Usos terapéuticos Anfotencina B Doxorrubicina Ventajas Dirección específica Reconocimiento de células y órganos del cuerpo Desventajas Análisis exhaustivo de la elección de: Antigeno Diana Función del anticuerpo Selección del tipo del entrecruzador a utilizar

02 Vectores Virales

Los vectores virales son sistemas que utilizamos como ayuda en el proceso de transferencia de un gen exógeno al interior de la célula. Ellos facilitan la entrada y biodisponibilidad intracelular del material genético a transducir y, por consiguiente, su funcionamiento correcto.(Rozalen J, 2003)

2.1 Retrovirus

Gammaretrovirus

Los retrovirus gamma y lentivirus han sido diseñados para llevar el material genético a las células y conducir a una integración estable en el genoma

Contienen 3 génes:gag: el grupo específico de antígenos, proteína de la cápsida y de la matriz sin actividad enzimática. pol : la transcriptasa inversa, proteasa e integrasa. env: proteínas de la envuelta del virus (transmenbrana y superficial).

Ventajas: eficiente transfección, integración estable en la célula huésped, uso simple, expresión permanente, no provocan respuesta inmune, transduccion eficiente

Desventajas: Bajas concentraciones, mutagénesis, silenciamiento de la expresión génica, extinsion del transgen in vivo, requieren proliferacion celular

2.1 Retrovirus

Gammaretrovirus

Promotor interno

El vector gama retroviral contiene: LTRs región 5’U3, región R y región 3’U5 PBS: se requiere para la transcriptasa reversa SD y SA: sitios de splice PSE: señal de empaquetamiento PPT: sitio de polypurinas El vector del promotor interno: contiene los mismos elementos menos la region SD y SA

Expresión de dos genes

Para expresar dos genes: Los mismos elementos que el vector gama retroviral pero varia en las regiones SD y SA, en el promotor y el sitio interno de entrada a ribosoma respectivamente comos e muestra en las imagenes.

Producción

Primero se obtiene un plásmido que contiene el ADN proviral

Procedimiento

Mediante procedimientos de clonación estándar, se amplifica en bacterias y se purifica.

Este plásmido luego se transfecta en una línea celular de empaquetamiento, es decir, una línea celular, generalmente de origen murino, que expresa los genes retrovirales gag, pol y env,

Una vez transfectado en una línea celular de empaquetamiento, el plásmido que contiene el vector retroviral se transcribe a partir de la LTR 5'

A continuación, el cDNA proviral se integra en el genoma de la célula huésped mediante IN

Una vez integrado, el ARNm expresado por el vector provirus ya no es infeccioso, ya que ninguna de las proteínas retrovirales está presente

Lentivirus

En los lentivirus son virus cuyo periodo de incubación es muy largo, se sabe que hasta seis genes adicionales regulan la expresión viral y son importantes en la patogenia de la enfermedad in vivo.Tat: participa en la transactivacion donde el producto de un gen viral participa en la activación transcripcional de otros genes del virus.Rev: se necesita para la expresión de las proteínas estructurales virales y facilita la exportación desde el núcleo de transcritos virales no empalmados. Nef: incrementa la infectividad del virus, facilita la activación de los linfocitos T inactivos, disminuye la expresión de CD4 y de los antígenos Tipo I del complejo de histocompatibilida Vpr incrementa el transporte del complejo de preintegración viral al interior del núcleo y también detiene las células en la fase G2 de su ciclo. Vpu promueve la degradación de linfocitos CD4. Flanqueado por LTRs, 5U3 región R y 3'U5, sitios de splicing, PBS, señal de empaquetamiento, genes estructurales, sitio polyA

Ventajas: Transfección en celulas en no división, uso in vivo, integración del genoma de la célula huésped, no provocan respuesta inmune, transduccion eficiente

Desventajas: Necesita un pseudotipo , extinsion del transgen in vivo, requieren proliferacion celular, generacion de virus competentes ya sea en la preparación en la recombinación in vivo, mutagenesis

El primer plásmidoContiene en su forma de ADN proviral, el vector de transferencia génica, que porta el gen terapéutico. Este ADN proviral contiene, en orientación 5' a 3',LTR viral 5', PBS y el sitio de corte y empalme 5'-SD, gen gag eψ: el marco de lectura abierto del gen se cierra mediante la inserción de un codón de parada para bloquear la traducción; gen env RRE región, sitio de empalme 3'-SA;un promotor

Los vectores lentivirales de segunda generación implican el uso de un diseño de tres plásmidos similar al de los vectores de primera generación, sin embargo, en el plásmido de empaquetamiento, además de gag y pol, se eliminan todos los genes accesorios.

Requieren cuatro plásmidos. El primer plásmido corresponde al vector de transferenciaEn el transgen se deleta la región U3 y se usa un promotor. El de empaquetamiento solo contiene los genes gag y pol Rev es expresado en un tercer plasmido, Mas de la VSV-G

2.2 Adenovirus

El primer adenovirus se aisló en 1953 del tejido adenoide El genoma adenoviral consiste en una molécula de ADN lineal de doble cadena de 36 kb en el caso de Ad2 y Ad5, que lleva en los dos extremos dos secuencias idénticas en orientación inversa, estas regiones actúan como orígenes de la replicación del ADN de todo el genoma.

Organización del genoma de adenovirus. Los genes tempranos se muestran en azul, los genes tempranos tardíos en gris y los genes tardíos en rojo. MLP: mayor promotor tardío. Para cada gen, se indican las principales proteínas codificadas. Las flechas indican la dirección de la transcripción. ITR: repetición terminal invertida

2.2 Adenovirus

Para la realizacion de los vectores de primera generacion se realiza una deleción en genes como E1 y E3 . En la segunda generación no se incluyen genes tempranos del E1 y E4 dandole una capacidad de 14 kb y en la primera generacion de 8 KB

Producción

2.2 Adenovirus

La producción de vectores adenovirales requiere un procedimiento de dos pasos

Ventajas: eficiente transfeccion, alto nivel de expresion del transgen, producción de altas concentraciones, transfeccion en celulas en división, amplio rango de tejido. Desventajas: trasnsfeccion transitoria, respuesta inmune inflamatoria muy alta

1)Primero la generación de un vector de ADN genómico con la secuencia de interés, su replicación y empaquetamiento para obtener preparaciones virales infecciosas. 2) El segundo paso la producción de partículas de vectores infecciosos, generalmente se obtiene en células humanas, denominadas células auxiliares, que proporcionan todas las funciones necesarias en trans en el caso de primera y segunda generación.

2.3 Adenovirus asociados

En la imagen se observan los promotores p5, p19, p40, los codones AUG para la traducción de las proteínas codificadas por Cap y el sitio de poliadenilación. La parte inferior muestra la estructura de los ARNm virales, indicando la organización intrón-exón, y de las proteínas codificadas. ITR: repetición terminal invertida; An: cola poliA. BAmpliación de la región ITR, con la indicación del sitio de unión de Rep RBS y el sitio de resolución terminal TRS. La ultima imagen representa la estructura del vector donde se encuentran los ITR, , el promotor, el transgen , la region polyA .

2.3 Adenovirus asociados

Ventajas: derivado de un virus no patogeno , producciones de altas concentraciones, infección de celulas en no división , expresión persistente y a largo plazo. Desventajas: limitación de empaque 5kb, perdida del vector de manipulacion, tropismo limitado.

Producción: Para la produccion se requieren 3 componentes: 1) el genoma del VAA que contiene el transgen, elementos resuladores y los ITRs 2) Los genes Rep y Cap 3) genes E2A, E4 Y ARN VA del virus colaborador. Ademas se reqiere el uso de células HeLa HEK-293

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