HPLC chromatographie

Contrôle des produits de Santé

TP : HPLC

Blanc Zoé Doueil-Lapp Maud Chalabi Halima Le Wendeline Ghanmi Inès Pach Gabin Jamin Alan

Séance 1

Sommaire

I. IntroductionII. Molécules étudiées III. Paramètres de l'analyse IV. Optimisation des paramètres d'analyse V. Conclusion

Introduction

Objectif

Effectuer une analyse HPLC en phase inverse et étudier la séparation d'un mélange de 4 composés en optimisant la méthode utilisée : → Changement de composition de la PM → Test d'une PM iso-élusive → Changement de température de l'analyse

Phase inverse

• RP-HPLC = Reverse Phase – High Performance Liquid Chromatography
• Phase stationnaire apolaire composée de gel de silice greffé en C18

• Phase mobile polaire avec un solvant fort et un solvant faible

• Séparation des molécules apolaires (lipophiles)
• Les solutés polaires sont moins retenus par la phase stationnaire (donc sortent en premiers)

Caractéristiques des molécules

1. Nitrobenzène : C6H5NO2

Peu soluble dans l'eau mais bonne solubilité dans l'alcool, l'éther et le benzène Maximum d'absorbtion à 260 nm Log P = 1,85 (lipophile) Cycle aromatique et groupement NO2

2. Nitrotoluène : C₇H₇NO₂

Soluble dans l'eau et les solvants organiques (l'alcool, l'éther, le benzène, l'acétone et le chloroforme) Maximum d'absorbtion à 259 nm Log P = 2,3 (lipophile) Cycle aromatique, groupement CH3 et NO2

3. α-Tétralone : C10H10O

Insoluble dans l'eau et soluble dans les solvants organiques Maximum d'absorbtion à 247 nm Log P = 2 (lipophile) Cycle aromatique et double liason d'oxygène

10

4. Toluène : C7H8

Soluble dans l'eau et dans les solvants organiques (éthanol, acétone, hexane, dichlorométhane) Maximum d'absorbtion à 261 nm Log P = 2,7 (lipophile) Cycle aromatique, groupement CH3

11

5. Uracile : C4H4N2O2

Peu soluble dans l'eau, soluble dans l'eau chaude, insoluble dans l'alcool et l'éther Maximum d'absorbtion à environ 260 nm Log P = -1 (hydrophile) Cycle aromatique, 2 groupements NH et deux doubles liaisons carbonne/oxygène

12

Ordre hypothétique d'élution

1. Uracile (temps mort)
2. Nitrobenzène
3. α-tétralone
4. Nitrotoluène
5. Toluène

Log P = -1 LogP = 1,85 Log P = 2 Log P = 2,3 Log P = 2,7

13

Paramètres de l'analyse

14

Appareil utilisé

HPLC Thermo-Fisher

Pompes

Injecteur

Colonne et four

Détecteur

15

Caractéristiques de la colonne

Nom : Atlantis Composition PS : Sillice dC18 Longueur : 100 mm, 150 mm Diamètre : 4,6 mm Taille des particules : 3 µm

16

Composition de la phase mobile

Deux phases mobiles sont testées lors de la réalisation de ces travaux pratiques :

17

Conditions d'analyse

- Débit : 1 mL/min pression correcte et retention des solutés- Détecteur : 260 nm + DAD entre 200 nm et 400 nm noyau aromatique - Volume injectée : 5 µL - Température : 30°C répétabilité des temps de rétention

18

Optimisation de la méthode

19

A. Etude du temps de rétention

20

1. Définition

Force éluante = capacité de la phase mobile à détacher les solutés de la phase stationnaire. En phase inverse : Plus les solutés sont polaires plus ils sont élués rapidement (affinité avec la phase mobile) Mode isocratique = mode de séparation chromatographique dont la composition de phase mobile (proportion) reste constante tout le long de l'analyse.

21

2. Etude du temps de retention

a. 100% ACN

22

2. Etude du temps de retention

b. ACN/EUP (80/20)

23

2. Etude du temps de retention

c. ACN/EUP (60/40)

24

2. Etude du temps de retention

d. ACN/EUP (50/50)

25

3. Identification des solutés

La dernière molécule n'est pas analysée seule, elle est identifiée par déduction.

26

B. Variation de pression et sélectivité

27

1. Définition

Loi de Darcy :

28

2. Proportions de la phase mobile

- Viscosité EAU : 1,002 cP - Viscosité ACN : 0,334 cP

29

2. Phase mobile EUP/MeOH

→ Méthanol plus visqueux que l'acétonitrile (0,551 cP) → Dans ce cas et selon la loi de Darcy : pression ACN/EUP < pression MeOH/EUP ACN/EUP (60/40) : 98 barMeoH/EUP (60/40) : 193 bar

30

B. Changement de température et efficacité

31

1. Influence sur le temps de rétention

↗ T°C induit une ↘ de la viscosité de la phase mobileDonc ↘ des intéractions des solutés avec la phase stationnaire ⇒ Si T°C ↗, alors TR ↘

32

2. Influence sur la pression

↗ T°C induit une ↘ de la viscosité de la phase mobile Logiquement et d'après la loi de Darcy : ↘ de la viscosité induit ↘ pression

→ PM EUP/MeOH

33

Conclusion

34

Conclusion - Résultats globaux

35

1. Facteur de rétention

k ≈ 2-5 : correctk < 1 : le soluté sort trop tôt k > 10 : temps d’analyse très long

36

1. Facteur de rétention

37

2. Résolution

Résolution = qualité de séparation de deux pics voisins.

La valeur obtenue doit être au minimum égale à 1,5 pour que les deux pics soient exploitables.

38

2. Résolution

39

3. Symétrie

Permet de déterminer la symétrie d’un pic en le séparant par une droite partant du maximum du pic et s’abaissant jusqu’au 1/20 de sa hauteur et étant perpendiculaire à la ligne de base.

0,8 < AS < 1,8 sinon asymétrie trop importante

40

3. Symétrie

41

4. Efficacité

Le nombre de plateaux théoriques correspond au nombre de fois qu'un composé sera échangé entre la phase mobile et la phase stationnaire.

⇒Plus une colonne est efficace, plus le pic est fin et plus le pouvoir séparateur est grand.

Colonne C18 150mm, 4,6mm → N ≈ 12500

42

4. Efficacité

43

Séance 2

44

Sommaire

I. IntroductionII. Composition de la forme pharmaceutique étudiée III. Conditions chromatographiques IV. Résultats V. Conclusion

45

Introduction

46

Objectif

Effectuer le dosage en acide acétylsalicylique d'un comprimé d'apirine Vitamine C UPSA afin d'en vérifier la teneur

47

Composition de la forme pharmaceutique d'un comprimé

48

1. Aspirine ou acide acétylsalicylique

Rôle : Substance active Peu soluble dans l'eau Log P = 1,2 (lipophile) pKa = 3,5 M = 180,16 g/mol Groupement acide carboxylique et ester

49

2. Acide ascorbique ou vitamine C

Rôle : Substance active Facilement soluble dans l'eau Log P = -1,6 (hydrophile) pKa = 4,1 M = 176,12 g/mol 4 groupements hydroxyle et une double liaison oxygène

50

3. Acide benzoïque (benzoate de sodium)

Rôle : Excipient Soluble dans l'eau (20°C) Log P = 1 (lipophile) pKa = 4,2 M = 122,12 g/mol Groupement acide carboxyliqye

Autres exipients : acide citrique anydre, bicarbonate de sodium, povidone, sodium

51

Paramètres de l'analyse

52

A. Conditions chromatographiques

- Débit : 1 mL/min pression correcte et retention des solutés- Détecteur : 276 nm + DAD entre 210 nm et 300 nm noyau aromatique - Volume injectée : 5 µL - Température : 30°C répétabilité des temps de rétention

53

B. Composition de la phase mobile

La phase mobile polaire se compose d'EUP acidifiée avec 0,1% (v/v) d'acide acétique pur et d'acétonitrile (70/30)

54

1. Préparation de l'eau acidifiée

a. Volume à prélever

55

1. Préparation de l'eau acidifiée

b. Détermination du pH théorique

56

1. Préparation de l'eau acidifiée

c. Détermination du pH théorique

57

2. Intéret

- Forme ionisé : pH de la PM > pKa de la molécule - Forme moléculaire : pH de la PM < pKa de la molécule pKa (aspirine) = 3,5 pKa (acide ascorbique) = 4,1 > 3 : forme moléculaire pKa (acide benzoïque) = 4,2 Formes moléculaires → plus longtemps retenus sur le PS ↳Acidification de l'eau = meilleure rétention des solutés

58

3. Ordre hypothétique d'élution

1. Acide acétylsalicylique : pKa = 3,5 2. Acide ascorbique : pKa = 4,1 3.Acide benzoïque : pKa = 4,2

1. Acide ascorbique : logP = -1,6 2. Acide benzoïque : logP = 1 3. Acide acétylsalicylique : logP = 1,2

59

Résultats

60

1. Facteur de rétention de l'acide acétylsalicylique

2 < 2,43 < 5 → facteur de rétention correct

61

2. Choix des points de gamme

→ Gamme étalon composée de 5 concentrations : 4 concentrations encadrant la concentration théorique C0 → 5 points répartis de façon homogène sur le domaine

Sachant que C0 = 100% (33,0 mg/100,0 mL) les concentrations étalons établies sont :

62

3. Préparation du comprimé d'aspirine

1. Un comprimé d’aspirine est dissous dans 200 millilitres d'EUP (→ éprouvette graduée) à l’aide d'un erlenmeyer de 500 millilitres. 2. Le mélange est passé aux ultrasons avant d'être transvasé dans une fiole jaugée de 250 millilitres. 3. L’erlenmeyer est nettoyé et les eaux de rinçage sont récupérées dans la fiole afin de ne rien perdre du comprimé dissous. 4. Le volume de la fiole est ensuite complété jusqu’au trait de jauge avec de l’EUP et la solution est mélangée par retournement. 5. 5,0 millilitres de cette préparation sont prélevés (→ pipette jaugée) et versés dans une fiole jaugée de 250,0 mL avant d'être complétés au trait de jauge avec la solution EUP/ACN (70/30) préalablement réalisée. Le tout est mélangé par retournement. 6. Le mélange est filtré sur un filtre seringue nylon 0,45 µm avant d'être mis en vial et analysé.

63

4. Test statistique de validation de la droite

Etude de la linéarité : y = ax + b y : Aire a : Pente Ici on obtient : y = 19,101645x + (-0,3730) x : Concentration b : Ordonnée à l'origine r2 = 0,9993 > 0,999

64

4. Test statistique de validation de la droite

On veut vérifier que la pente est différente de 0. Pour cela on effectue le test de student : Ta est comparée à la valeur T° (α, v = n-2) lue dans la table de STUDENTSi Ta > t° alors la pente est significativement différente de zéro.

Ici → Groupe 1 : a = 19,101 Groupe 2 : a = 16,464 T°= 3,182 → Ta > T° : rejet de l’hypothèse nul donc “a” (la pente) différent de zéro

65

4. Test statistique de validation de la droite

On veut vérifier que l’ordonnée à l’origine n’est pas différente de zéro. Pour cela on effectue le test de student : Tb est comparée à la valeur T° (α, v = n-2) lue dans la table de STUDENT Si Tb < T° alors l’ordonnée à l’origine n’est pas statistiquement différente de 0.

Ici →Groupe 1 : b = -0,3730 Groupe 2 : b = -0,222 T° = 3,182 → Tb < T° donc b = 0 : la droite passe par l’origine

66

5. Calcul de la concentration expérimentale

67

5. Calcul de la concentration expérimentale

68

5. Calcul de la teneur en aspirine

69

Conclusion

70

Conformité des comprimés

Teneur en acide acétylsalicylique comprise entre [98,4 ; 100] donc conprimé conforme avec une concentration en aspirine correcte → Proche de 100% ≈ 33 mg par comprimé

71