cultivo celular

Módulo 1

Técnica aséptica básica.

01 MATERIAL

-Guantes-Bata laboratorio -Pipeta estéril(10ml) -Dispensador pipeas -Máscara facial -Etanol 70% -Medio estéril -Placa cultivo(35mm)

02 técnicas básicas

1. Utilizar bata laboratorio y mascarillas.2. Usar guantes desechables. Área de trabajo. 1.Esterilizar superficie. 2.Disponer de todo el material.3.Organizar bien el área.

03 . Pipeteo

1. Transferir grandesvolúmenes de líquidos usando pipetas desechables (10 ml o 25 ml). 2. Trabajar sólo dentro de su rango de visión. 3. Transferir pequeños volúmenes con pipetas pasteur(estériles). 4. Limpiar inmediatamente cualquier derrame.

04 BOTELLAS Y FRASCOS

1. Las botellas deben estar verticales si están abiertas. 2. Los frascos de cultivo celular deben estar horizontalmente si están abiertos. 3. Evitar el vertido desde un contenedor estéril a otro.

05 USO DE LAS CÁMARAS DE INCUBACIÓN

06 PRÁCTICA DE LA TÉCNICA ESTÉRIL

1.Cubrir la cámara de incubación con papel de aluminio para evitar la luz. 2.Limpiar el interior de la cámara de incubación con etanol al 70%. 3.Colocar la cámara en un área libre de corrientes(temperatura entre 24-27°C) Evitar ventanas o respiraderos.

1. Sacar de la nevera el medio de práctica estéril, y dejarlo atemperar en la poyata(10 mins/T ambiente). 2. Rociar el tubo que contiene el medio de esta práctica con etanol al 70% y equipo trabajo. 3.Transferir 2 ml de medio a una placa de cultivo celular de 35 mm(evitar que la pipeta roce los bordes de la placa/tubo para evitar la contaminación)

06 PRÁCTICA DE LA TÉCNICA ESTÉRIL

Bacterias: los medios parecen nublados y pueden tener una película blanca en la superficie. Hongos: aparecen micelios filamentosos delgados que cubren el cultivo celular. Levadura: partículas redondas que son más pequeñas que las células de insectos.

4. Cubrir la placa y colocarla en la cámara incubadora de cultivo celular preparada. Incubar la placa durante la noche a temperatura ambiente. 5. Retirar todas las pipetas, los frascos y otros materiales del área de trabajo.Y limpiar la superficie con etanol al 70%. 6. Guardar en la nevera, a 4ºC, todos los medios y soluciones de stock utilizadas. 7. Al día siguiente, recuperar la placa del incubador y,evitar que el medio de cultivo sobresalga de la placa observarla al microscopio.

MÓDULO 2:

Observación y evaluación del estado celular

01 MATERIAL NECESARIO

-Guantes -Máscara facial -Bata de laboratorio -Etanol al 70% -Pipetas estériles de 10 ml

02 METODOLOGÍA

1. Recuperar un frasco de células de la incubadora de cultivo celular. 2. Comprobar que el medio está limpio y transparente.

03 METODOLOGÍA

3. Examinar las células bajo un microscopio. Buscar signos de células enfermas que podrían indicar que en los medios celulares ha disminuido la cantidad de nutrientes NOTA: Si el cultivo de células está contaminado, añadir al frasco 1 ml de solución de lejía al 10%. Después de una hora,desechar el cultivo.

04 METODOLOGÍA

4. Anotar en el registro de datos: el aspecto de las células, la claridad del medio y la presencia o la ausencia de contaminación. Dibujaruna imagen de la morfología celular. NOTA: Si es posible,hacer foto e imprimirlas.

05 METODOLOGÍA

5. DETERMINAR si las células requieren tiempo adicional para crecer y necesitan ser alimentadas o bien llegan al 80%-90% de confluencia y necesitan ser amplificadas.

06 METODOLOGÍA

6. Si las células no están listas para ser amplificadas, volver a colocar el frasco en la incubadora. Revisar las células para monitorear el crecimiento, registrando los datos en el registro de datos de cultivo celular.

Módulo 3:

Manipulación del cultivo de células de insecto

01 MATERIAL NECESARIO

02 SUSTITUCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

-Guantes -Bata de laboratorio -Vaso de precipitados para la eliminación de residuos. -Dosificador/pera de pipetas. - Pipetas estériles de 10 ml. -Pipetas de volumen variable. -Pipetas estériles pasteur

1. Recuperar el tubo de Medio de cultivo para las células de insecto de la nevera (a 4ºC). 2. Retirar 4 ml del medio del frasco que tiene las células en cultivo usando una pipeta pasteur estéril, aspirando suavemente. 3. Desechar el medio retirado del frasco en un recipiente de desecho. 4. Añadir 4 ml de medio de cultivo para células de insecto fresco usando una pipeta pasteur estéril nueva. 5. Volver a depositar el frasco con las células de insecto en la cámara de incubación.

-Tubo estéril de 15 ml. -Máscara facial. -Etanol al 70%. -Medio de cultivo de células de insecto. -Placa de cultivo celular de 35mm. - Rascadores de placas -Puntas de pipeta (estériles). -Cámara de contaje de células (Neubauer)

04 .NUEVO PASE (METODOLOGÍA NO APLICABLE EN OBJETIVOS DEL DESARROLLO DEL KIT)

03 PASES DEL CULTIVO CELULAR

1. Con ayuda del rascador estéril y sin que toque el exterior del frasco, frotar suavemente la superficie. 2. Usando una pipeta estéril de 10 ml pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo.Y sin aspirar aire para evitar la formación de espuma. 3. Utilizar un microscopio para confirmar el desprendimiento de las células de insecto de la parte interior del frasco.

DILUIR el homogenado celular con medio de cultivo fresco, obteniendo 2 frascos de células. Depositar los frascos de células en el incubador y observarlas periódicamente. Preparación del cultivo para la realización de la práctica: Etiquetar las placas con las iniciales del grupo de estudiantes correspondiente. Marcar 5 placas con la etiqueta de Módulo IV.

05 Protocolo para la obtención de la densidad celular deseada

06 Protocolo para la obtención de la densidad celular deseada

1. Añadir 15 µl en la pestaña de una de las 10 áreas de la cámara de contaje de células (cámara de Neubauer). 2. Contar el número de células presentes en cada una de las 9 zonas de contaje. 3. Diluir el homogenado de células, en un tubo estéril de 15 ml, hasta llevarlas a una densidad de 0,075 millones / ml. 4. Añadir con una pipeta pasteur estéril1 ml de medio de cultivo fresco a cada una de las placas de 35 mm, previamente identificadas.

5. Añadir con una pipeta pasteur estéril 1 ml del homogenado de células d=0,075M/ml, a cada placas de cultivo. 6. Mover cada una de las placas hacia adelante y hacia atrás dibujando una cruz para distribuir las cél en la placa. 7. Examinar las cé en el microscopio y confirmar que hay células en las placas y que las cél son redondas y claras. 8. Anotar datos observados en el registro de datos de cultivo celular. 9. Después de 24h de añadir las cél a las placas, confirmar en el microscopio , la fijación de las células.

Módulo 4:

Viabilidad y Cinética del crecimiento celular

01 MATERIAL NECESARIO

02 PROTOCOLO DE TINCIÓN CELULAR CON EL COLORANTE AZUL DE TRIPANO:

-Guantes -Bata de laboratorio -Vaso de precipitados para la eliminación de residuos. -Azul de tripano. - Pipetas de volumen variable. - Pipetas estériles pasteur. -Máscara facial. -Etanol al 70%. -Tampón fosfato (PBS 1x). - Rascadores de placas. -Puntas de pipeta (estériles). - Tubos de microcentrífuga.

1.Recuperar, a las 24 h del cultivo, una de las placas de 35 mm.Identificar la placa como día 1 y anotar la confluencia. 2.Rascar suavemente la placa del cultivo celular llegando a la superficie. 3.Pipetear las células 3 veces con una pipeta pasteur para disociar el cultivo. 4.Identificar 2 tubos eppendorf y añadir 1 ml del homogenado celular en cada uno de los tubos. 5.Centrifugar los tubos a 1000 rpm durante 5 minutos.

03 PROTOCOLO DE TINCIÓN CELULAR CON ELCOLORANTE AZUL DETRIPANO:

6.Aspirar el sobrenadante (medio de cultivo) con una pipeta de volumen variable y evitar que se aspiren las células presentes. 7.Añadir 500 µl de tampón fosfato (PBS 1x) a cada uno. 8.Añadir a uno de los tubos de microcentrífuga los 500 µl del homogenado celular. 9.Transferir 10 μl de colorante azul de tripano en un tubo de microcentrífuga. Añadir 10 μl de la suspensión celular 10.Incubar cél durante 1 min aT ambiente.

04 PROTOCOLO DE TINCIÓN CELULAR CON EL COLORANTE AZUL DETRIPANO:

11.Transferir 12 μl ( una gota) de la suspensión de células teñidas de azul de tripano a una muesca. 12.Examinar la cámara de recuento en el microscopio con objetivo de menor aumento. 13.Enfocar líneas de la rejilla en cámara. 14.Contar todas las células vivas y las muertas (incorporan el colorante y se observan de un color azul) que hay. 15.Guardar el hemocitómetro a T ambiente.

05 CÁLCULO DEL NÚMERO DE CÉLULAS VIABLES Y NO VIABLES

Relación existente entre el número de células viables respecto del número total de células. Fórmula: células viables / ml y de las no viables / ml x factor de multiplicación x factor de dilución. Factor de multiplicación = 4500. Factor de dilución = 2

06 CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR

1.Realizar un contaje celular y un ensayo de viabilidad cada 24 horas. 2. Utilizando una hoja de papel, registrar/dibujar los datos de concentraciones celulares (células/ml)en función del tiempo (días) de cultivo. 3.Identificar y rotular cada una de las fases del crecimiento: latencia, crecimiento exponencial y estacionaria para el cultivo celular. 4. Seleccionar intervalo de tiempo durante la fase de crecimiento y calcular tiempo de duplicación.