TEMA 7: TÈCNIQUES D'HIBRIDACIÓ DELS ÀCIDS NUCLEICS

TEMA 7: TÈCNIQUES D'HIBRIDACIÓ DELS ÀCIDS NUCLEICS

https://molcyt.org/2013/12/19/insitu/

ÍNDEX

Marcatge de les sondes

Concepte d'hibridació

Tipus d'hibridació

Tècniques d'hibridació:

Aplicació

In situ

Les sondes

En suport sòlid

1. Concepte d'hibridació

La hibridació es fa servir per detectar seqüències específiques d'àcid nucleics en una mostra. Es defineix com la unió d'una cadena monocatenària d'ADN/ARN d'una mostra (seqüència diana) amb una cadena monocatenària d'ADN/ARN marcada al laboratori (sonda) per formar una estructura bicatenària híbrida. S'aconsegueix gràcies a la complementarietat de les bases nitrogenades (ponts d'H). Homodúplex: ADN-ADN, ARN-ARN Heterodúplex: ADN-ARN

IMPORTANT: S'ha de desnaturalitzar l'ADN de la mostra(+T/pH àlcali)

+ info

https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Hibridacion

2. Tipus d'hibridació: Segons el medi

• En fase líquida: la reacció d'hibridació sonda-diana es realitza en dissolució.
• In situ: la sonda s'aplica sobre mostres en la seua ubicació natural (talls de teixits, cèl·lules intactes, preparacions de cromosomes, etc)
• FISH

• En suport sòlid: la mostra d'ADN diana s'inserta en una matriu sòlida i s'hi afegeix una solució que inclou la sonda (o a la inversa)
• Hibridació genòmica comparada (CGH)
• Southern Blot
• Northern Blot

3. Aplicació de les tècniques d'hibridació

• Diagnòstic de malalties
• Anàlisi de perfils d'expressió gènica
• Identificació de microorganismes patògens
• Detecció de gens associats a malalties genètiques (deleció/duplicació) i al càncer
• Estudi de l'herència evolutiva comuna entre espècies

4. Sondes

Les sondes (probes) són segments d'ADN/ARN que han sigut marcats amb enzims, substrats antigènics, quimioluminiscència o radioisòtops. Hi ha tres tipus segons la naturalesa de l'àcid nucleic:

• Sondes d'ADN: mitjançant clonació
• Sondes d'ARN: mitjançant transcripció
• Sondes sintètiques: oligonucleòtids obtinguts per síntesi química

S'elegeix la sonda segons l'especificitat (capacitat de discriminar la diana amb la qual ha d'hibridar) i la sensibilitat que es vol aconseguir (probabilitat de detectar quantitats mínimes de l'híbrid sonda-diana)

5. Marcatge de la sonda: Marcadors

El marcatge és el procediment d'assenyalar la sonda utilitzada per poder visualitzar els resultats. Hi ha 2 tipus:

• Marcadors que permeten la detecció directa de l'híbrid:
• Fluorocroms: (cianines) compostos químics que emeten llum al excitar-se amb llum UV

• Marcadors que requereixen mètodes indirectes de revelat (autoradiografia):
• Isòtops radioactius (32P i 3H)

• Haptens (digoxigenina i biotina)

Recordatori estructura ADN

5. Marcatge de la sonda: Mètodes

La majoria de mètodes fan servir reaccions enzimàtiques per incorporar nucleòtids marcats a la sonda. Els següents tres mètodes es realitzen després d'haver sintetitzat la sonda (clonació, transcripció o síntesi química): 1. DESPLAÇAMENT DE TALLS (NICK-TRANSLATION)

NO cal desnaturalitzar l'ADN

5. Marcatge de la sonda: Mètodes

1. DESPLAÇAMENT DE TALLS (NICK-TRANSLATION)

5'

3'

5'

3'

https://www.researchgate.net/figure/DNA-labelling-by-nick-translation_fig3_282076257

5. Marcatge de la sonda: Mètodes

2. ENCEBAT A L'ATZAR (RANDOM PRIMING)

Sí cal desnaturalitzar l'ADN (94ºC)

5. Marcatge de la sonda: Mètodes

2. ENCEBAT A L'ATZAR (RANDOM PRIMING)

https://slideplayer.com/slide/4643034/

5. Marcatge de la sonda: Mètodes

3. MARCATGE TERMINAL (END LABELING)

NO cal desnaturalitzar l'ADN

Recordatori estructura ADN

5. Marcatge de la sonda: Mètodes

3. MARCATGE TERMINAL (END LABELING)

3'

5'

3'

5'

Nucleòtid trifosfat a nucleòtid difosfat

https://www.researchgate.net/figure/End-labeling-of-DNA_fig4_282076257

5. Marcatge de la sonda: Mètodes

4. MARCATGE DURANT LA SÍNTESI

El marcatge es realitza al mateix temps que es sintetitza la sonda. L'ADNpolimerasa sintetitza la cadena amb els nucleòtids marcats del medi.

5. Marcatge de la sonda: Mètodes

6. Hibridació: "Astringència" (stringency)

L'astringència (exigència) es pot definir com el conjunt de condicions baix les quals es produeix una hibridació més estable o menys estable. Una major astringència exigeix una major complementarietat sonda-diana perquè es puga produir la hibridació.

Complementarietat

ADN

ARN

6. Hibridació: "Astringència" (stringency)

MODULADORS:

• Concentració de la sonda >Concentració = > Hibridació
• Composició de la sonda > G-C = >Hibridació estable
• Complementarietat bases >70% =Hibridació homòloga (<70% sols en baixa astringència)
• Temperatura >T (90ºC) trenca ponts d'H, separant brins. <T = >Hibridació
• pH i productes químics >pH (àlcali) trenca ponts d'H i provoca repulsió entre brins per ionització dels grups fosfat. <pH = >Hibridació
• Agents químics: Urea i formamida redueixen l'estabilitat del dúplex = <Hibridació
• La força iònica >[sales] = <ionització dels grups fosfat = <repulsió = >Hibridació
• Longitud cadenes >Longitud = >estabilitat per ponts d'H = >Hibridació

6. Hibridació: "Astringència" (stringency)

BAIXA ASTRINGÈNCIA (permissiu)

• BAIXA TEMPERATURA
• ALTA FORÇA IÒNICA

ALTA ASTRINGÈNCIA (restrictiu)

• ALTA TEMPERATURA
• BAIXA FORÇA IÒNICA

7. Procediment general d'hibridació

1. FASE DE PREHIBRIDACIÓ
• Preparació mostra i suport
• Varia segons tècnica: digestió enzimàtica, electroforesi, transferències...
2. FASE D'HIBRIDACIÓ
• S'ha de tindre en compte la Tm (Temperatura de fusió: 50% de desnaturalització)
• Es sol realitzar a 37ºC, 42ºC o 65ºC
3. FASE DE RENTAT POST-HIBRIDACIÓ (fase crítica)
• Mantindre els híbrids sonda-diana i eliminar restes de sonda i els híbrids imperfectes (mismatch)
• Es realitza amb un tampó en condicions d'alta astringència (+T, -Força iònica)

8. Tècniques d'hibridació in situ: FISH

FISH (Fluorescent In Situ Hybridization): la sonda es marca amb fluorocroms que permeten la visualització amb llum UV al microscopi de fluorescència. Permet detectar i identificar de manera precisa alteracions cromosòmiques numèriques (monosomia, trisomia, poliploidia) i estructurals (deleció, duplicació, translocació, inserció, etc) en cromosomes metafàsics, nuclis interfàsics i inclús seccions de teixit congelat. Complementa els resultats obtinguts amb tècniques citogenètiques tradicionals (cariotip).

Alteracions cromosòmiques estructurals

https://www.sysmex.es/academia/centro-de-conocimiento/sysmex-blog/oncologia/que-es-el-fish.html

8. Tècniques d'hibridació in situ: FISH

1. Sondes específiques de gen o locus: hibriden amb seqüències concretes d'una banda d'un cromosoma o d'un gen

• Alteracions estructurals específiques: delecions, duplicacions i translocacions en metafase i interfase

https://www.researchgate.net/figure/Result-of-FISH-analysis-using-LSI-probe-TUPLE-1-from-DiGeorge-velocardiofacial-syndrome_fig2_5795283

8. Tècniques d'hibridació in situ: FISH

2. Sondes centromèriques: hibriden amb seqüències repetitives properes al centròmer

• Alteracions numèriques (monosomia, trisomia) en metafase i interfase de cromosomes concrets

https://www.researchgate.net/figure/FISH-image-of-metaphase-using-X-centromere-probe-The-abnormal-X-chromosome-lacks-a_fig4_225289835

8. Tècniques d'hibridació in situ: FISH

3. Sondes subtelomèriques: hibriden amb seqüències properes als telòmers

• Alteracions estructurals (delecions)

https://www.researchgate.net/figure/Image-of-chromosomes-from-an-hTERT-telo1-cell-stained-with-the-telomere-PNA-probe_fig1_6270754 https://www.researchgate.net/figure/Chromosome-analysis-by-the-G-banding-technique-revealed-the-chromosome-1q44-qter_fig4_264393482

8. Tècniques d'hibridació in situ: FISH

4. Sondes de pintat cromosòmic: cada cromosoma complet queda marcat d'un color diferent

• Alteracions numèriques i translocacions (NO delecions, duplicacions)

https://biomodel.uah.es/citogene/dynacare/fishinfo.htm https://www.researchgate.net/figure/FISH-results-with-whole-chromosome-painting-WCP-for-chromosomes-3-and-7-A-B-and-7-and_fig3_269172143

8. Tècniques d'hibridació in situ: Derivada de FISH

FISH MULTICOLOR (M-FISH): identificació diferencial de regions subcromosòmiques (bandes)

• Alteracions estructurals complexes
• Combinació de sondes de pintat cromosòmic

https://www.semanticscholar.org/paper/Multicolor-FISH-probe-sets-and-their-applications.-Liehr-Starke/d8ed4b132341aefca82ef243ca4f81c4d9e21432/figure/2 https://metasystems-probes.com/en/probes/mfish/d-0125-060-di/

8. Tècniques d'hibridació in situ: FISH

Laboratori fabricant de sondes

Procediment d'hibridació

Instruccions d'ús

Aplicació específica FISH

• Diagnòstic prenatal: aneuploidies (sondes locus dels cromosomes 13, 18, 21, X i Y)
• En Pediatria: síndromes de microdeleció/microduplicació
• Diagnòstic preimplantacional: selecció embrions lliures d'anomalies cromosòmiques
• Diagnòstic d'espermatozoides: detectar monosomia, trisomia i triploidia dels cromosomes 13, 18, 21, X i Y
• Malalties oncohematològiques: diagnòstic i seguiment

Activitat FISH

Activitats

9. Hibridació en suport sòlid: aCGH

ARRAY-HIBRIDACIÓ GENÒMICA COMPARADA Tècnica d'hibridació comparativa que permet detectar duplicacions o delecions del material genètic al comparar una mostra d'ADN problema (Cy5) amb una mostra d'ADN de referència (Cy3) sense alteracions. En aquest cas es marca la mostra, no la sonda.

• Es du a terme amb microarrays: matriu formada per punts, cada un dels quals contè una sonda monocatenària específica d'ADN. Aquestes estan dissenyades de tal forma que representen totes les regions d'interès al llarg de tot el genoma.

• Permet estudiar múltiples gens i múltiples regions diferents del gen a l'hora amb sondes d'alta especificitat.

Microarray

9. Hibridació en suport sòlid: aCGH

ARRAY-HIBRIDACIÓ GENÒMICA COMPARADA

• ADN problema + ADN referència ambdós extrets, digerits i amplificats (++nº còpies)
• S'inserta la mateixa proporció de cada ADN i aquests competeixen per hibridar amb les diferents sondes (són complementàries als dos ADN).
• S'analitza la intensitat de la fluorescència amb ferramentes bioinformàtiques (escàner).

https://www.genosalut.com/tecnologias-diagnostico-genetico/array-cgh/

9. Hibridació en suport sòlid: aCGH

ARRAY-HIBRIDACIÓ GENÒMICA COMPARADA

• S'analitza la intensitat de la fluorescència amb ferramentes bioinformàtiques (escàner).

GROC: normal, no hi ha alteració ROIG: duplicació ADN problema VERD: deleció ADN problema

https://www.researchgate.net/figure/Characterization-of-the-present-duplication-using-array-CGH-analysis-right-and_fig4_5388631

Aplicació de la tècnica aCGH

• Estudis genòmics de cèl·lules tumorals
• Estudi noves síndromes

• Diagnòstic de malalties genètiques
• Diagnòstic prenatal
• Diagnòstic anomalies congènites múltiples
• Diagnòstic trastorns del desenvolupament i diversitat intelectual, autisme, etc.

9. Hibridació en suport sòlid: Southern Blot

Permet localitzar i identificar fragments d'ADN de diferents fonts separats per electroforesi en gel d'agarosa. Mesura la quantitat i mida de seqüències específiques. Es detecta amb autorradiografia.

Substituïda per la qPCR

https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Electroforesis

9. Hibridació en suport sòlid: Southern Blot

FASES:

1. Extracció i digestió de l'ADN amb enzims de restricció
2. Separació dels fragments d'ADN per electroforesi en gel d'agarosa
3. Desnaturalització fragments
4. Transferència a membrana de nitrocel·lulosa o nailon
5. Hibridació amb sonda radioactiva
6. Rentat post-hibridació
7. Detecció amb autorradiografia (es coloca la membrana junt a una pel·lícula radiogràfica en una caixa aïllada de la llum. La pel·lícula registra les posicions on hi ha desintegració radioactiva.)

https://www.genome.gov/genetics-glossary/Southern-Blot

Aplicació de la tècnica Southern Blot

• Elaboració d'empremtes genètiques
• Estudi de mutacions estructurals
• Detecció de seqüències adquirides

L'empremta genètica és una tècnica utilitzada per determinar la identitat probable d'una persona en funció de la seqüència de nucleòtids.

• Investigacions criminals
• Estudis forenses
• Proves de paternitat

https://www.mun.ca/biology/scarr/Southern_Blot_analysis.html

9. Hibridació en suport sòlid: Northern Blot

És una tècnica derivada de la Southern blot. Serveix per identificar ARN (ARNm) Les fases són les mateixes que la Southern blot però no cal ni digerir l'ARN (té una mida menuda) ni desnaturalitzar (ARN és monocatenari).

• Estudi d'expressió gènica:
• Comprovar si un gen s'expressa o no
• Comparar expressió entre teixits, pacients/persones sanes...

Western blot per a proteïnes

https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Northern-blot

Activitats

https://bmcmedgenet.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2350-15-79

REPÀS FINAL