Extracción de RNA por Trizol
Equipo 5: Lucía Otero, Fernanda Villa, Yamila Rojas, Emilio Fernández
Laboratorio de Genomica y Proteomica
27/10/22
Pasos:
01. Homogeneización
02.Separación de las fases
03. Precipitación
04. Resuspención
01. Homogeneización / Lisis celular
1. Agregas la muestra en un tubo de ensayo2. Colocas Trizol para evitar la degradación del ARN 3. Se homogeneiza la mezcla en el vortex durante 1 minuto 4. Dejar reposar durante 5 mins.
A nivel molecular
El ARN se establece en el trizol, se desactivan las RNAasas (que degradan al RNA) y se completa la disociación de ácidos nucleoproteicos sin que se degrade por completo el RNA
(De izquierda a derecha)Imagen 1: colocar el TrizolImagen 2: Colocación de la muestra en el vortexImagen 2: Homogeneizar la mezcla (se aprecia luego la separación de fases que se eplicará en el siguiente paso.
02. Separación de las fases
A nivel molecular
1. Lavado con cloroformo2. Agitar por 15 segundos 3. Incubar 2-5 mins a RT 4. Centrifugar 5-15 min a 2-8°C. 5. Transferir fase acuosa a un nuevo tubo sin aspirar interfase blanca que contiene ADN.
- El cloroformo hace la partición de ARN en el sobrenadante acuoso para su separación.
- Las fases quedan separadas por el diferente peso molecular de las moléculas (ADN, RNA, Proteínas) y la densidad de las mismas que las hace desplazarse a los diferentes niveles del tubo con la centrigfugadora
(De arriba a abajo y de izquierda a derecha)Imagen 1: Agregación de cloroformo Imagen 2: Centrifugación de la muestraImagen 3: Indicación de lo que se encuentra en cada fase del tuboImagen 4: Extracción de la fase acuosa (RNA) del tubo con micropipeteo
03. Precipitación
La precipitacion es de 20 a 40 minutos dependiendo del tipo de muestra
- Se añade isopropanol así como 0.8 m de citrato de sodio
- Se incuba por 10 min a RT, entre 10 y 15 min a 4ºC
- Se retira lo sobrante
A nivel molecular
El isopropanol es un disolvente de grupos hidroxilos, rompe los puentes de hidrógeno permitiendo la precipitación del RNA el cuál es insoluble en este medio.
Imagen 1: Precipitación del RNA utilizando isopropanol
04. Resuspensión
Específicos
1. Se disuelve el pellet en 50-100 µl de H2O filtrado o DEPC2. Se sube y se baja el pellet 3. Se calienta a 55-60 º C por 10 min
DE 15 A 30 MIN ES ESTE PROCEDIMIENTO 1. se usa pellet de 70% 2. Este se añade al vortex para preparar la RNase o de igual manera se pude lavar con ethanol directo 3. Se incuba popr 10 min a 55-60ºC 4. Se transfiere a un tubo eppendorf 5. Se gira por 5 min a 4ºC
A nivel molecular
El pellet esta formada para uso farmaceutico, el cual se inocula debajo de la piel para que haya una absorción constante. Estan compuestos microorganismos para dar la estabilidad necesaria
(De izquierda a derecha)Imagen 1: RNAse Imagen 2: Vortex de muestra con RNase Imagen 3: pellet de RNA Imagen 4: DEPC
10.
Bibliografía
- Thermo Fisher Scientific. 2016. “How to Isolate RNA from Tissue or Cells.” YouTube Video. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=L5XlB8KkKt4&t=86s.
- “La Extracción de ARN Con Trizol/Tri | Reef Recovery.” 2022. Reefrecovery.org. Enero 19, 2022. https://reefrecovery.org/es/la-extracci%c3%b3n-de-arn-con-trizoltri/.
- Cosmos Online. 2017. “Información Técnica Del Alcohol Isopropilico (2-Propanol), Isopropanol.” Cosmos Online. 2017. https://www.cosmos.com.mx/wiki/alcohol-isopropilico-2-propanol-isopropanol-cxdw.html.
Graciaspor su atención
¿Alguna pregunta?
Extracción de RNA por Trizol - Equipo 5
Lucia Otero
Created on October 27, 2022
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Extracción de RNA por Trizol
Equipo 5: Lucía Otero, Fernanda Villa, Yamila Rojas, Emilio Fernández
Laboratorio de Genomica y Proteomica
27/10/22
Pasos:
01. Homogeneización
02.Separación de las fases
03. Precipitación
04. Resuspención
01. Homogeneización / Lisis celular
1. Agregas la muestra en un tubo de ensayo2. Colocas Trizol para evitar la degradación del ARN 3. Se homogeneiza la mezcla en el vortex durante 1 minuto 4. Dejar reposar durante 5 mins.
A nivel molecular
El ARN se establece en el trizol, se desactivan las RNAasas (que degradan al RNA) y se completa la disociación de ácidos nucleoproteicos sin que se degrade por completo el RNA
(De izquierda a derecha)Imagen 1: colocar el TrizolImagen 2: Colocación de la muestra en el vortexImagen 2: Homogeneizar la mezcla (se aprecia luego la separación de fases que se eplicará en el siguiente paso.
02. Separación de las fases
A nivel molecular
1. Lavado con cloroformo2. Agitar por 15 segundos 3. Incubar 2-5 mins a RT 4. Centrifugar 5-15 min a 2-8°C. 5. Transferir fase acuosa a un nuevo tubo sin aspirar interfase blanca que contiene ADN.
(De arriba a abajo y de izquierda a derecha)Imagen 1: Agregación de cloroformo Imagen 2: Centrifugación de la muestraImagen 3: Indicación de lo que se encuentra en cada fase del tuboImagen 4: Extracción de la fase acuosa (RNA) del tubo con micropipeteo
03. Precipitación
La precipitacion es de 20 a 40 minutos dependiendo del tipo de muestra
A nivel molecular
El isopropanol es un disolvente de grupos hidroxilos, rompe los puentes de hidrógeno permitiendo la precipitación del RNA el cuál es insoluble en este medio.
Imagen 1: Precipitación del RNA utilizando isopropanol
04. Resuspensión
Específicos
1. Se disuelve el pellet en 50-100 µl de H2O filtrado o DEPC2. Se sube y se baja el pellet 3. Se calienta a 55-60 º C por 10 min
DE 15 A 30 MIN ES ESTE PROCEDIMIENTO 1. se usa pellet de 70% 2. Este se añade al vortex para preparar la RNase o de igual manera se pude lavar con ethanol directo 3. Se incuba popr 10 min a 55-60ºC 4. Se transfiere a un tubo eppendorf 5. Se gira por 5 min a 4ºC
A nivel molecular
El pellet esta formada para uso farmaceutico, el cual se inocula debajo de la piel para que haya una absorción constante. Estan compuestos microorganismos para dar la estabilidad necesaria
(De izquierda a derecha)Imagen 1: RNAse Imagen 2: Vortex de muestra con RNase Imagen 3: pellet de RNA Imagen 4: DEPC
10.
Bibliografía
- Thermo Fisher Scientific. 2016. “How to Isolate RNA from Tissue or Cells.” YouTube Video. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=L5XlB8KkKt4&t=86s.
- “La Extracción de ARN Con Trizol/Tri | Reef Recovery.” 2022. Reefrecovery.org. Enero 19, 2022. https://reefrecovery.org/es/la-extracci%c3%b3n-de-arn-con-trizoltri/.
- Cosmos Online. 2017. “Información Técnica Del Alcohol Isopropilico (2-Propanol), Isopropanol.” Cosmos Online. 2017. https://www.cosmos.com.mx/wiki/alcohol-isopropilico-2-propanol-isopropanol-cxdw.html.
Graciaspor su atención
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