ONTOGENIA DE LB

activación, ontogenia y maduración de los linfocitos B

Fases

1. Maduración

01

Med. osea, saco vitelino o hígado fetal. Es indep. de Ag. extraño

Estadío de Maduración

2. Activación

02

Ig secretadas

Organos linf. Es dep. de Ag y LTh. Cambio clase, maduración afinidad

Médula ósea

Órganos linfoides periféricos

3. Proliferación

Ag independiente

Ag dependiente

03

Es dep. de Ag y LTh. Generación de células plasmáticas y de memoria

Selección Positiva y Negativa

Definición: Proceso por el cual los progenitores de los linfocitos se diferencian en la médula ósea a linfocitos B maduros que pueblan los tejidos linfoides periféricos.

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87

Formación de células B efectoras: Fases y Localización

Órganos linfoides periféricos Dependientes de Ag y de interacción con LTh

• Activación-Cambio de isotipo-Maduración de la afinidad
• Proliferación-Amplificación clonal de linfocitos B específicos
• Generación de células plasmáticas productoras de Abs
• Generación de células de memoria

Médula ósea Mecanismos independientes de Ag y de interacción con LTh

• Maduración: Reordenamiento de genes de Igs
• Expresión diferencial de CDs
• Generación de LB inmunocompetentes
• Selección negativa de LB autoreactivos (Clases de TOLERANCIA)
• Diferenciación y proliferación

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21

89

Proliferación pre-B

Estimulación de la recombinación de la cadena κ

Inhibe la transcripción de la cadena ligera subrrogada

Inhibición de la recombinación de la cadena H (exclusión alelica)

90

CheckPoints= Controles de diferenciación

*Edición del receptor Clases TOLERANCIA

91

CheckPoints= Controles de diferenciación

Selección negativa: En médula se producen 5x107 LB/día, sólo salen a circulación un 5-10%, el resto son eliminados: Selección negativa: reordenamientos improductivos, LB autoreactivos Edición del receptor: Si hay interacción fuerte con autoantígenos los LB pueden entrar en anergia y en lugar de morir paran la maduración y se reordena de nuevo la cadena ligera para evitar reactividad cruzada (clases de Tolerancia) No todos los autoantígenos se expresan en médula ósea, hay una posterior selección negativa en la periferia (clases de Tolerancia)

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Maduración y activación de linfocitos B

Tdt CD19 CD14 HLA-DR CD9 IL7-R

Tdt CD19 CD9 CD10 CD24 CD40 HLA-DR

Mu citop CD19 CD9 CD10 CD24 CD40 HLA-DR

CD19 CD20 CD24 CD21 HLA-DR mIgM mIgD

Pro B

Pro-pre B

Pre B

B inmaduro

B maduro

stroma

IL-7

Médula ósea

sangre y ganglios

CD19 CD20 CD24 CD21 mIgM mIgD CD40 HLA-DR

CD19: Proliferación. Marcador linaje CD20: Canal de Calcio-señalización. Marcador linajeCD21 (CR2): Receptor complementoCD40: Interacción con CD40L (LT). Activación-diferenciación, cambio isotipo, LB memoria. CD40-CD40L inhibe apoptosis de LB CD79a, CD79b: Forman parte del complejo BCR

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Activación de LB

Médula ósea

Generación de repertorios Inducción de tolerancia

Periferia

Repertorios autotolerantes Linfocitos vírgenes de vida corta

Médula ósea

LB que llegan a los folículos linfoides

LB que NO llegan a los folículos linfoides

LB vígenes de vida larga (3-8 semanas)

Linfocitos autoreactivos Linfocitos que fracasan en su maduración No llegan a los órganos linfoides secundarios vida media corta (2-3 días)

Estimulación por Ags Interacción con LTh

LB memoria de vida larga (años) Niveles altos de IgG, IgA, IgE

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Generación de diversidad en el SI

El SI debe ser capaz de reconocer virtualmente todo agente patógeno tanto si existe como si aun no ha sido generado (futuros)

¿PORQUÉ PODEMOS RESPONDER CONTRA TODO?

Se generan millones de Abs específicos diferentes Número mayor que el número de genes en el organismo

• UN GEN PARA UN SÓLO ANTICUERPO

• UN GEN PARA VARIOS ANTICUERPOS: recombinación

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Generación de diversidad en el SI

LB

Cada individuo puede producir células B y T con 1015 a 1018 especificidades diferentes.

especificidades diferentes.

LT

Tenemos anticuerpos y receptores LT (TCR) que reaccionan prácticamente con cualquier compuesto incluyendo aquellos que son sintéticos y que nunca existirían en la naturaleza.

Cualquier compuesto, incluyendo sintéticos o que nunca existirán

La mayoría de esta diversidad es generada mediante un reordenamiento de segmentos génicos de los cromosomas que codifican para las cadenas de estos receptores, lo cual ocurre previo a la exposición a antígeno.

A pesar de las diferencias entre los Abs y los receptores de las células T, los procesos moleculares que dan lugar a la diversidad son similares. La diversidad de células B y T producidas se llama REPERTORIO. De este repertorio, una fracción pequeña (<5%) responderá contra un determinado antígeno

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Diversidad de las Regiones Hipervariables

La diversidad de estas regiones permite que el anticuerpo (receptor) pueda reconocer una gran diversidad de antígenos.

Especificidad

97

Teorías sobre la formación de Abs

98

Teorías sobre la formación de Abs

Teoria selección clonal

Teoría de selección clonal. Jerne y Burnett: El SI es capaz de generar Receptores Ags antes incluso de que tenga lugar el contacto. ¿Se producen tantos Abs como Ags? ¿Hay un gen distinto para cada Ab?

Dreyer y Bennett: Existe una región constante y otra variable. Los genes de las Igs vienen codificados por al menos dos genes diferentes. Contrario al dogma central de la biología “un gen, una proteína”

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Teorías sobre la formación de Abs

Teoría selección clonal

Teoría de la selección clonal Tonegawa: Demuestra las hipótesis de Dreyer y Bennet. Proporciona soluciones al problema de la diversidad. Cantidad limitada de genes que permutan de forma casi infinita para dar lugar a inmunoglobulinas con especificidades para todos los antígenos. Novel en 1987 Propone:

1. Múltiples genes: variables (V) y constantes (C) en la línea germinal.
2. Mutación somática
3. Recombinación somática entre elementos génicos.

100

Organización génica de la cadena pesada de las Igs

Cadena pesada

Letra

Significa

N°

Tamaño

Función

Variable

~50

~95 aa

Diversidad

~20

~3-6 aa

Región variable

Unión

~6

~13 aa

Regiones Constantes

Constante

9*

~110 aa

*Un locus por cada isotipo

102

Mecanismos implicados en la generación de diversidad

Proceso

Diversidad

1. Múltiples genes V de la línea germinal
2. Diversidad combinatorial: VJ y VDJ
3. Agrupación de cadenas H con dos tipos de cadenas ligeras

4. Mutagénesis insercional o Diversidad N; Adición de N-nucleótidos (x3) y P 5. Conversión genética; 6. Exclusión alélica 7. Imprecisiones de la recombinación

Genética

Recombinatorial

Línea germinal

Unión

1. Hipermutaciones somáticas en H y L:

V ~10,000 veces más frecuentes que lo basal después de la activación de la célula B. Ocurre después de la estimulación antigénica. Genera la maduración de afinidad: seleción de mutantes que poseen una afinidad por el antígeno en respuestas secundarias.

Mutacional

Linfocito maduro

103

Variabilidad en la estructura de las inmunoglobulinas

1. Reordenamiento de cadenas pesadas

2. Reordenamiento de cadenas ligeras

3. Ensamblaje de ambas cadenas

Janeway 8th edition

104

105

Organización génica de la cadena pesada de las Igs

La recombinación genética de la cadena pesada precede a la de la cadena ligera. La información de los dominios variables se encuentra en tres segmentos (V-D-J).

1. Múltiples genes V de la línea germinal

106

Organización génica de la cadena pesada de las Igs

2. Diversidad combinatorial: Diversas regiones VDJ se agrupan de múltiples formas diferentes

Cromosoma 14 humano

Los segmentos genéticos Vh, Dh y Jh recombinados producen secuencias variables, CDR

Mecanismos de recombinación: Existen secuencias señalizadoras para la recombinación (RSS), heptámeros y Nonámeros, reconocidas por el complejo VDJ recombinasas. Las específicas en linfocitos son RAG-1 y RAG-2.

107

Organización génica de las cadenas pesadas de las Ig

108

Locus de las cadenas ligeras de las Igs

• Dos loci separados – kappa (κ) y lambda (λ) en 2 cromosomas diferentes
• Expresan cadenas livianas κ y λ
• Tienen segmentos génicos V y J (no segmentos D)

• Si el rearreglo de la cadena pesada es exitoso, ocurre el rearreglo de cadena κ

• Si el rearreglo de κ es exitoso, la célula B expresa IgM con cadenas livianas κ

• Si el rearreglo de κ no es exitoso, el gen λ se rearregla

• Si el rearreglo de λ es exitoso, la célula B expresa IgM con cadenas livianas λ

109

Organización génica de las cadenas ligeras de las Igs

Cromosoma 2 humano

Cadena κ

Segmentos VL y JL se Combinan de forma aleatoria Diversidad combinatorial

Si hay 31 segmentos V y 5 segmentos J. ¿Cuál sería el número máximo de reordenamientos que podría producirse en este locus?

Teóricamente 31x5, aunque hay factores que aumentan la variabilidad y por tanto el número de reordenamientos.

110

Organización génica de las cadenas ligeras de las Ig

Cadena λ

Cromosoma 22 humano

Los segmentos genéticos VL, y JL se recombinan de forma aleatoria DIVERSIDAD COMBINATORIAL: Diversas regiones VJ

111

Reordenamiento Secuencial y Ordenado

112

PERO HAY MAS DIVERSIDAD DE LA QUE PERMITEN ESTOS MECANISMOS

segmentos

cadenas

V D J C

diversidad potencial

100 30 6 (9)

18000x9

35 - 5 1

175

30 - 3 3

90

TOTAL (segmentos variables): 165 + 30 + 14 = 164 SEGMENTOS

1- Combinación al azar de segmentos V (D) J: 18000 H, 175 κ, 90λ 2- Asociación al azar de cadenas H y L: 18000 x (175+90)= 4,7x10

Pero hay unos 10 BCR !

11

113

Secuencia de acontecimientos durante la recombinación VDJ:

Mecanismos de recombinación: Recombinación V(D)J Regla 12-23

V, D y J están rodeados de secuencias de señalización de la recombinación (RSS) Formadas por: Heptámeros-Separador-Nonámero

Estas secuencias señalizadoras son reconocidas por el complejo VDJ recombinasas (RAG-1 y RAG-2).

RSS

114

Secuencia de acontecimientos durante la recombinación VDJ:

Inversión

Secuencia de acontecimientos en la recombinación VDJ:

01

Deleción

02

Sinapsis

03

Escisión

Apertura de la horquilla y procesamiento de los extremos

04

05

Unión

video 1

115

3.-Agrupación de cadenas H con dos tipos de cadenas L

video 2

116

4.- Mutagénesis insercional o Diversidad N; Adición de N-nucleótidos (x3) que aumentan la diversidad

Pro B stage

TdT: deosxinucleotidil Transferasa terminal

117

5.- Exclusión alélica

Conversión génica

118

6.-Imprecisiones de la recombinación

• La imprecisión en la recombinación somática amplifica la diversidad combinatorial. Nucleótidos P (Palindrómicos).

• En los genes H, además, se añaden nucleótidos N sin molde (No codificados en línea germinal)

• Conversión génica: Sustitución de bloques génicos por otros bloques de la región V de pseudogenes

Nucleótidos P: Añadidos por una ADN polimerasa

Nucleótidos N: Añadidos por la TdT (deoxinucleotidil transferasa terminal)

119

7.-Hipermutaciones somáticas en H y L

Hipermutación somática y aumento de afinidad

Periferia

Médula ósea

Generación de repertorios Inducción de tolerancia

Repertorios autotolerantes Linfocitos vírgenes de vida corta

LB que llegan a los folículos linfoides

LB vígenes de vida larga (3-8 semanas)

LB que NO llegan a los folículos linfoides

Linfocitos autoreactivos Linfocitos que fracasan en su maduración No llegan a los órganos linfoides secundarios vida media corta (2-3 días)

LB memoria de vida larga (años) Niveles altos de IgG, IgA, IgE

Estimulación por Ags Interacción con LTh

Ocurre después de la estimulación antigénica. Genera la maduración de afinidad: seleción de mutantes que poseen una afinidad por el antígeno en respuestas secundarias.

120

Hipermutaciones somáticas en H y L: maduración de la afinidad

del centro germinal

SUPERVIVENCIA

CD40/CD40L-AID

121

Hipermutaciones somáticas en H y L: maduración de la afinidad

Mechanisms?? AID= Activation Induced Deaminase is involved

video 3

122

Hipermutaciones somáticas en H y L: maduración de la afinidad

Clones de LB con diferentes mutaciones se van a seleccionar en función de su afinidad por el Ag

123

Citoquinas para el cambio de Isotipo

Linfocito B

TGF

IL-4 + IL-13

Linfocito T

IgE

IgG

IgA

Bloquea el cambio de isotipo Se mantiene sólo IgM

IL-4+IL-5

INF

INFg bloquea

124

8.- Reordenamientos para el cambio de Isotipo: IgM-IgD

Splicing alternativo

125

8.-Reordenamientos para el cambio de Isotipo

126

8.- Reordenamientos para el cambio de Isotipo

127

8.- Reordenamientos para el cambio de Isotipo

Isotype switching

AID= Activation Induced Deaminase

128

8.- Reordenamientos para el cambio de Isotipo: IgA

129

8.- Reordenamientos para el cambio de Isotipo: IgE

video 4

130

Reordenamientos para el cambiode Ig de membrana a secretada

131

Resumen: Reordenamientos para el cambio de Isotipo

132

Ontogenia: Maduración

133

PREGUNTAS