VECTORES

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

TERAPIA GÉNICADRA. BRENDA GONZÁLEZ HERNÁNDEZ

VECTORES VIRALES Y NO VIRALES

KARINA NATALÍ MUÑIZ TORRES 1845323DENISSE ALEJANDRA ESCALÓN RUBIO 1727580 DAVID ISAAC LÓPEZ RUIZ 1870166

SAN NICÓLAS DE LOS GARZA, A 13/09/2022.

VECTORES

Un vector génico es un agente que transfiere información genética, por algún medio, de un organismo a otro. En biotecnología, un vector de clonación es utilizado para portar el ADN recombinante desde una célula donadora hasta la célula receptora en la que se inserta el gen que se quiere transferir.

El vector óptimo y el sistema de entrega dependen de: -Las células diana y sus características -La duración de la expresión -El tamaño del material genético que se incorporará en el vector .

VECTORES NO VIRALES

Métodos de introducir material genético en células que suponen la síntesis de una molécula determinada y no están basados en virus. La transfección es el proceso por el cual se introducen, de forma deliberada, ácidos nucleicos exógenos en el interior de células eucariotas.

Estos son ADN desnudo, basados ​​en partículas y químicos. Se dividen en 4 categorias: Químicos} Físicos De Fusión Endocitosis

VentajasRelativa seguridad Capacidad para transferir genes grandes Especificidad de sitio Propiedades no inflamatorias, no tóxicas y no infecciosas.

DesventajasBaja eficiencia de transfección Expresión transgénica relativamente pobr

VECTORES QUIMICOS

PROCESO:

1. Se empea buffer con fosmato.2. ADN para transfectar se sumerje en una solucion con cloruro de calcio.3.El DNA se precipita.

transferencia con fosfato de calcio

Se utiliza una solución buffer para formar un coprecipitado de ADN y fosfato de calcio sobre el cultivo celular. Este precipitado ingresa a la célula por endocitosis

VENTAJAS

• No toxica
• Economico

DESVENTAJAS

• Problema en llegar al nucleo
• Eficiencia del 10%
• Expresion del gen transitoria
• La utilizacion se ve reducida a cultivos celulares en aplicaciones ex vivo.

MEJORAMIENTO

-Para mejorar la eficiencia de la tranfeccion se impactan las celulas con DMSO o glicerol -Para mejorar la eficiencia de la transfeccion emplear un sistema de tamponado con BES

VECTORES FISICOS

produccion

1. El transgen se coloca en una micropipeta de vidrio
2. Se pica la celulay se introduce la secuencia genetica

Equipo: Equipo de optica, brazos mecanicos moviles y celulas aisladas.

microinyeccion

ADN introduccido directamente al núcleo Dispositivo: microagujas/micromanipulados Células individuales

• Tecnologia de electrodos Flutter para la penetracion de membranas pequenas con precision y sin da;ar la membrana
• WPI MICRO ePORE utilizaca para la microinyeccion eficiente de una diversa gama de compuestos
• PICOPUMB neumaticas PV820 PV830 para simpplificar la inyeccion celular.

EMPLEADO

ventajas

desventajas

• Preciso
• Alta transfeccion
• Utilizada in vivo e in vitro
• In vitro usado en embriones

• Costoso y lento
• Eficiencia del 30%
• Requiere equipo

• Organismos transgenicos
• Introduccion de RNA antisentido
• Introduccion de ADN en la piel

biobalistica

PROCESO:

MICROPROYECTILES

la utilización de microproyectiles recubiertos del DNA que se desea transferir, que son disparados sobre los tejidos vegetales a altas velocidades, atraviesan la pared y la membrana celular y llevan al interior de la célula los genes de interés para su posterior integración en el genoma

1. Colocar el material genetico sobre la bala de metal 2. Por medio de una descarga electrica se dispara el proyectil 3. El disparo penetra hasta 20 capas de la celula

COMPONENTES

• Transgen
• Balas de metal
• Pistola de genes

MEJORAMIENTO:

Modificaciones en los parametros biologicos y fisicos tales como el promotor, el dispositivo de aceleracion de particulas,, los parametros del acelerador, y el preacondisionamiento osmotico.

EMPLEADO

• Protocolo de vacunacion
• Transformacion de velulas vegetales
• Platas transgenicas

SONICACION

PRODUCCION

1. La muestra se somete a ultrasonidos en presencia del vector
2. La duracion de la sonicacion es inferior a los 15 minutos.

El proceso de sonicación consiste en la rotura de la membrana celular mediante ultrasonidos mediante la induccion de poros transitorios, donde el ADN foraneo entra al interior de la celula

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

• Bajo costo
• Simplicidad
• Incrementa permeabilidad
• Usado en paredes basculares corazon y musculo

-Sonicador -Vector -Muestra

ELEMENTOS

MAGNETOFECCIÓN

AUMENTO DE LA PRESION HIDRODINAMICA

Utiliza la química de las nanopartículas magnéticas y campos magnéticos para concentrar partículas que contienen ácido nucleico para apuntar a las células del cuerpo. De tal manera que la dosis de vector aplicada se concentra en las células en pocos minutos.

Se inyectan grandes volumenes de DNA a los tejidos induciendo presion hidrodinamica y perforando la membrana por lo tanto, la entrega de genes intracelulares mediante la entrada de fluidos

-Sencillo y eficaz. -Transfección en minutos.

-Partícula menor a 50nm (problema en el direccionamiento magnetico). -Partícula de más de 5 micrometros (retarda la entrada de nanopartículas).

• Por lo general, invasivo

• Eficiencia baja y transitoria

PROCESO:

1. Preparan de la solucn para ser inyectada 2. Se deben inyectar 15-50 ug de ADN plasmidico. 3. El volumen total de solución inyectada debe corresponder al 10% del peso corporal 4. Inyecciónintravascular de ADN hidrodinámico. 5. Una vez que la inyección se realiza con éxito, se pasa a recuperación 6. La extracción de tejido para preparar extractos de tejido debe realizarse 24 a 48 h después de la inyeccion 7. Una vez extraido, el tejido se enjuaga con PBS y se congela inmediatamente en nitrógeno liquido.

1- Agregar partículas catiónicas al plasmido. 2- Colocar las partículas y el plasmido en un buffer. 3- Colocar pulso magnetico en la platina. 4- Introducir gen a la célula.

ELECTROPORACION

PRODUCCION

La electroporación es una técnica que se utiliza para aumentar la permeabilidad de la membrana celular a iones y moléculas mediante pulsos cortos de altos campos eléctricos.

1. Preparar la celula y el plasmido con el transgen en un buffer
2. Aplicar pulso electrico en el electroporador
3. devolver las celulas a las condiciones de cultivo

COMPONENTES

• Buffer
• Muestra
• Electoporador
• Vector

MEJORAMIENTO

Nucleofeccion: Mejora la eficacia de transferencia al depositar el plasmido en el nucleo

VENTAJAS

DESVENTAJAS

• Las celulas se pueden aislar y hacer control de calidad
• Usado in vitro e in vivo

• Muerte celular
• Eficiencia baja y transitoria

INDUCCIÓN DE FUSIÓN: MODIFICANDO PH Y MEZCLANDO CON LÍPIDOS NÉUTROS.

VECTORES DE FUSIÓN

LIPOSOMAS

Su principal objetivo es la modificación de los ácidos nucleicos, promoviendo con moléculas capaces de reducir la hidrofília y asi poder neutralizar su carga, y asi tener una mayor captación celular.

Vesiculas cerradas, formadas por una o mas de dos capas lipídicas, las cuales rodean un núcleo. Transportan moleculas en diversas aplicaciones, como la quimioterapia o las aplicaciones cosméticas.

LÍPIDOS

VARIANTES: -Micelas. -Membranas biólogicas. -Liposomas.

Estas moléculas son insolubles en agua, pero se disuelven con gran facilidad en compuestos organicos. 3 tipos principales en las membranas celulares son: -Fosfolípidos -Colesterol -Glucolípidos

1. El DNA se introduce en el centro, para que entre a la célula con facilidad y se proteja el daño.

2. El DNA dentro del liposoma, es llamado LIPOPLEX.

Son anfipáticos (extremo hidrofílico y extremo hidrofóbico).

TIPOS: -Encapsulamiento -Compledo

-Cristalización del tejido. -Cinéticas variables.

-Liberación controlada. -Simple manufactura.

DNA desnudo

Se lleva a cabo la inyección directa de la parte codificadora de un tejido. Ahí, el DNA va vehiculizado en una solución sálina o sérica y generalmente es inyectado de manera intramuscular.

-No se integra al genóma. -Solo es utilizado in vivo.

-El porcentaje de transfección es bajo.

PROCESO:

1- Introducción de DNA en solución sálina o sérica. 2- Inyeción de manera intramuscular. 3- DNA endocitado a través de poro nuclear.

CLASIFICACIÓN DE LOS LIPOSOMAS

POLÍMEROS

ANIÓNICOS

-Transporta farmacos sítio específicos.

• Lipoplex de empaquetamiento.
• Membrana con carga negativa.

-Capacidad limitada al entrar al citosol.

MACROMOLÉCULAS Unión de pequeñas moléculas llamadas monomeros.

CATIÓNICOS

-Se condensan cargas positivas y negativas. -Formación de partículas de 20-100nm. -Reacciones electrostaticas.

Complejo de DNA + Polímero = POLIPLEX -Entra por atracción de cargas a la célula.

• Membrana con carga positiva.
• Lipoplex de complejo.

Los más utilizados:

-Aumenta tiempo en el liposoma. -Mejora la distribución. -Previene captura por el MPS.

NEUTROS

POLI-L-LISINA -Es catiónico. POLI-ETILENO-GLICOL -Aumenta la biodisponibilidad en sangre.

-Construyen lipoplex.

• Se fusionan con la membrana.

MEJORAMIENTO:

-No liberan el DNA dentro del citoplasma.

• Adición de lípidos fusogénicos.
• Virosomas para aumentar la fusión.

BENEFICIOS: -Aumenta biocompatibilidad, es de baja toxicidad, soluble en medio acuoso y poca inmunogenicidad.

MEJORAMIENTO: -Adicionar promotor o receptor para que sea sitio-específico.

VARIANTE

VECTORES DE ENDOCITOSIS

Las mOLECULAS QUE INDUCEN EL ESCAPE ENDOSOMICO son:

La Endocitosis es un proceso que permite la entrada de grandes macromoléculas polares en las células gracias a la formación de vesículas de membrana en la superficie celular, seguida de su internalización y tráfico intracelular.

Una vez internalizado el material dentro de las vesículas, aun no tienen acceso al interior de la célula, es decir, el espacio citosólico y los orgánulos, por lo que se requiere que la secuencia atraviese la membrana de los endosoma.

Lípidos catiónicos/polimeros catiónicos

Péptidos anfilíticos

Agentes lisosomotrópicos

-DOPE -6His-CM18-PTD4 -LLOME (tóxico)

MEDIADOS POR RECEPTOR

INMUNOLIPOSOMAS

Se agregan anticuerpos en la membrana del liposoma para aumentar la especificidad

SE COMPONE DE: -Liposoma catiónico -Fragmento de anticuerpo monocatenario -PEG

Complejps sintéticos se componen por un ligando dirigido específico de la célula, que se acopla a un elemento de unión al DNA y una fusión endosmolílica. Entregan genes a la célula de manera específica para el receptor.

Proceso de entrega:

1. Unión de DNA y el vector
2. Internalización
3. Tráfico subcelular
4. Escape vesicular
5. Importación nuclear
6. Desenpaquetado

Proceso de entrega:

1. Ligando por poliplex, reconoce los receptores específicos.
2. Poliplex endocitado.
3. Introducción del gen.

-Sitio-específico gracias a los anticuerpos. -Reduce la degradación del farmaco. -Mayor capacidad de carga.

-Sitio-específico gracias a los Ac. -Transferencia de genes exitosa.

-Dificil de escapar del liposoma. -Problemas en llegar al núcleo.

Función de los anticuerpos: -Dirigir al liposoma. -Inducir endocitosis.

Mas usado: -Anfotericina B -Docorrubicina

MEJORAS

-Agregar señales de lozalización nuclear. -Adicionar moléculas fusogénicas.

DENDRÍMEROS

Los dendrímeros son macromoléculas poliméricas sintéticas con periferia de carga positiva y que está compuesto de múltiples brazos monoméricos característicos que definen la generación y el tamaño.

MEJORAMIENTO:

-Diferentes estrategias de modulación estructural para reducir la citotoxicidad.-Uso de varios radicales para aumentar la biocompatibilidad.

PRODUCCIÓN:

COMPONENTES:

1. Los dendrímeros generalmente se preparan utilizando un método divergente o uno convergente.
2. (Divergente) el dendrímero crece hacia el exterior a partir de una molécula central multifuncional.
3. La molécula central reacciona con moléculas de monómero que contienen un grupo reactivo y dos latentes, lo que da lugar al dendrímero de primera generación.
4. Después, la nueva periferia de la molécula se activa para reacciones con más monómeros.

• Transgen.
• Dendrones.

-Robusta construcción covalente. -Inhiben las nucleasas dependientes de pH. -Control de estructura y tamaño.

-Algunos como PAMAM muestran baja estabilidad durante la esterilización por calor.-Más grande, más toxica.

Vectores virales

Generalidades

Tipos de vectores

Los vectores virales son partículas de virus no compemententes que han sido modificadas con la introducción de un transgen con el fin de generar una respuesta en el organismo. Para poderse multiplicar y llegar a la célula blanco, es necesario que el vector viral tenga secuencias de regulación en el transgen, además de señales de replicación y empaquetamiento. El principal problema de los vectores virales frente a los no virales es su poca capacidad de empaquetamiento.

Retrovirus

Adenovirus Asociado

Adenovirus

Vectores virales: Gamaretroviral

Genoma Viral

ELEMENTOS -LTRs (U3 R U5). -PBS: Transcripción inversa. -SA y SD: Sitios de Splice. -GENOMA VIRAL: Vector gammaretroviral -Señal de empaquetamiento. -PPT: Sitio de polipurinas. Basados en virus de Leucemia murina Mo-MLV

Vector del transgen

Método de Producción-Generación del vector con el transgen para transfectar a célula empaquetadora. El vector del transgen contiene señal empaquetadora. - En la célula empaquetadora se expresa los genes gag, pol y env. Se recomienda una transfección estable para armado inmediato de la partícula -El vector solo es capaz de tener un solo ciclo de infección. Precipitación con Fosfato de Calcio

Vectores virales: Gamaretroviral

Variantes del vector

Dos genes con promotor interno: Sin sitios de Splice.

Con promotor interno: Delección de los sitios de Splice.

Con secuencia de reconocimiento ribosomal (IRES).

Dos genes: Flanqueo por los sitios de Splice.

Vectores virales: Lentivirus

Genoma viral

Producción

Se necesitan 3 plásmidos (1 vector de transgén y 2 vectores de empaquetamiento). Los de empaquetamiento necesitan un promotor fuerte y el tercer plásmido se hace con el virus de estomatitis vesicular.

Primera generación

Primer vector de empaquetamiento

1er Vector de empaquetamiento: Deletar LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Y se mantienen los 9 genes del HIV-1.

GENES QUE SE CONSERVAN

Segundo vector de empaquetamiento

LTRs (U3 R U5). PBS: Unión del primer. SA y SD: Sitios de Splice. Vector lentiviral¿Qué elementos se conservan? Señal de empaquetamiento. PPT: Sitio de polipurinas. Promotor: No empaquetadora

Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Secuencia de VSV-G y PolyA.

Vectores virales: Lentivirus

Se quitan LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing.Se le quitan los genes accesorios de HIV-1 (nef, ref, vpu y vpr)

Segunda generacion

Primer vector de empaquetamiento

Genes que se conservan

• LTRs (U3 R U5).
• PBS: Unión del primer.
• SA y SD: Sitios de Splice.

• Señal de empaquetamiento.
• PPT: Sitio de polipurinas.
• Promotor: No empaquetadora.

Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Secuencia de VSV-G y PolyA

Segundo vector de empaquetamiento

Produccion

Se necesitan 3 plásmidos (1 vector de transgén y 2 vectores de empaquetamiento). Los de empaquetamiento necesitan un promotor fuerte y el tercer plásmido se hace con el virus de estomatitis vesicular.

Vectores virales: Lentivirus

Tercera generacion

Produccion

Se necesitan 4 plásmidos (1 vector de transgén y 3 vectores de empaquetamiento). Se utilizan los promotores de RSV y CMV.

Genes que conservan:

• LTRs (R U5). Sin U3.
• PBS: Unión del primer.
• SA y SD: Sitios de Splice.

Segundo vector de empaquetamiento

• Señal de empaquetamiento.
• PPT: Sitio de polipurinas.
• Promotor: No empaquetadora

Añadir promotor SRV. Se añade gen rev de HIV-1 y PolyA.

Primer vector de empaquetamiento

Tercervector de empaquetamiento

Deletar LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Solo gag, env y pol.

Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Secuencia de VSV-G y PolyA.

Vectores virales: Adenovirus

Primera generacion del vector

Al trabajar con adenovirus se debe considerar: -Su genoma tiene genes tempranos y tardíos. -Son los vectores más inmunogénicos; se tienen respuestas FUERTES. .

Los genes tempranos se denominan con la letra E y los genes tardíos con la letra L, los primeros son para replicación y los segundos para el ensamblaje.

Segunda generacion del vector

Vectores virales: Adenovirus

Para producir vector

• Se utilizan células HEK293 con DNA de Ad5 que tiene deletada la región ITR5´-Empaquetamiento-E1.
• 2. Se transfecta un plásmido que contiene región ITR5´-Empaquetamiento-Promotor-Transgen-PolyA.
• 3. Gracias a una recombinación dentro de la célula Helper los fragmentos se unen para tener la secuencia flanqueada por ITRs.

Vectores virales: Adenovirusasociado

TRANSGEN:

GENOMA: Es una molécula simple que contiene DNA de cadena sencilla y además esta flánqueado con ITRs. Los genes más importantes son: rep: Familia de proteínas para la replicación. cap: Familia de proteínas para la estructura viral.

PRODUCCIÓN

1. Se utiliza un plásmido que contiene al vector del transgen y otro plásmido que contiene rep y cap además de el genoma de un virus helper. 2. Se realiza la transfección el células HEK293 gracias a la técnica de fosfato de Calcio. 3. Una vez que se tienen a las células transfectadas se realiza una lisis celular para poder purificar a las partículas adenoasociadas. 4. La purificación se realiza con cloruro de Celsio y centrifugaciones. 5. Es necesario caracterizar la muestra para no tomar partículas del virus HELPER.

BIBLIOGRAFÍA

• Chis, A. A., Dobrea, C. M., Rus, L. L., Frum, A., Morgovan, C., Butuca, A., Totan, M., Juncan, A. M., Gligor, F. G., & Arseniu, A. M. (2021). Dendrimers as Non-Viral Vectors in Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy. Molecules (Basel, Switzerland), 26(19), 5976. https://doi.org/10.3390/molecules26195976
• Deonarain , P. (2005) Ligand-targeted receptor-mediated vectors for gene delivery. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 8:1, 53-69, DOI: 10.1517/13543776.8.1.53
• Mena-Enriquez, M., Flores-Contreras, L., & Armendáriz-Borunda, J. (2012). Vectores virales adeno-asociados: métodos de producción, purificación y aplicaciones en terapia génica. Rev Invest Clin, 64(5), 487-94.
• Moreno, B. R. (2010). Dendrímeros de estructura carbosilano y su uso como vectores no-virales en terapia génica y como agentes terapéuticos (Doctoral dissertation, Universidad de Alcalá).