Universidad Autónoma de Nuevo LeónFacultad de Ciencias Biológicas Licenciado en Biotecnología Genómica
VECTORES VIRALES & NO VIRLAES
DossierTerapia Génica
Dra. Brenda González Hernández
Gpo: 483
Matrícula
Alumnos
1846329 1941187
Pérez Escamilla ValeriaValenzuela Ahumada Luis Armando
Indice
06
04
03
05
Métodos Físicos
Biobalística / Electroporación
Vectores Químicos
Vectores
Métodos Físicos
Transferencia con fosfato de calcio
Vectores No Virales
Microinyección
07
08
09
10
De Fusión
Métodos Físicos
Métodos Físicos
DNA desnudo
Métodos Físicos
Liposomas
Sonicación
Aumento de presión Hidráulica
12
13
11
14
De Endocitosis
De Endocitosis
De Endocitosis
De Fusión
Dendrímeros
Inmunoliposomas / Mediados por receptor
Polímeros
20
16
15
18
Vectores virales
Vectores virales
Vectores virales
Vectores virales
Lentivirus / Adenovirus
Lentivirus
Gammaretrovirus
26
23
25
Bibliografía
Vectores virales
Cuadro Comparativo
AAV
VECTORES
Son vehículos que transportan el material genético a una amplia variedad de células, tejidos y órganos completos.
El vector óptimo y el sistema de entrega dependen de:
- Las células diana y sus características
- La duración de la expresión
- El tamaño del material genético que se incorporará en el vector .
Los vectores utilizados para la terapia génica son muy variados, pero actualmente se clasifican en términos generales como vectores virales y vectores no virales
Vectores no Virales
Ventajas
Generalidades
Relativa seguridadCapacidad para transferir genes grandesEspecificidad de sitioPropiedades no inflamatorias, no tóxicas y no infecciosas.
Mientras que los vectores virales son capaces de producir una alta eficiencia de transfección, las complicaciones de seguridad empujan las investigaciones hacia el campo de los vectores no virales; Estos son ADN desnudo, basados en partículas y químicos. Se dividen en 4 categorias:
- Químicos}
- Físicos
- De Fusión
- Endocitosis
Desventajas
Baja eficiencia de transfecciónExpresión transgénica relativamente pobre
Producción
Vectores Quimicos
- Se emplea un buffer con fosfatos
- El DNA para transfectar esta en una solucion con cloruro de calcio
- La combinación hace que se precipite el DNA
Transferencia con fosfato de calcio
Generalidades
La utilización del fosfato de calcio se basa en la capacidad que presentan los iones calcio para precipitar el ADN provocando que la célula, mediante endocitosis, introduzca el ADN en su interior.
Ventajas y Desventajas
Económico
No es tóxica
Mejoramiento
Eficiencia del 10%
- Impactar las células con glicerol o DMSO mejora la eficiencia de la transfección.
- Emplear un sistema tamponado con BES mejora la eficiencia de la transfección
- ProFection Mammalian Transfection System
- Calcium Phosphate Transfection Kit (Invitrogen)
Expresión del gen transitoria
Su utilización se ve reducida a cultivos celulares en aplicaciones ex vivo.
Problemas en llegar al núcleo
Mejoramientos
Vectores Fisicos
Bombas de inyección
- PicoPump neumáticas PV820 y PV830 se diseñaron para simplificar la inyección intracelular.
Penetrador de células milimétricas
Microinyección
- WPI MICRO-ePORE™ se puede utilizar para la microinyección eficiente de una diversa gama de compuestos y biomoléculas.
- Tecnología de electrodos Flutter ayuda en la penetración de membranas pequeñas, limpias y precisas sin rasgar ni dañar la membrana cuando se trabaja en la microinyección
Generalidades
Técnica donde el ADN es introducido por inyección directamente en el núcleo de las células gracias a la ayuda de un micromanipulador, evitando de este modo la degradación citoplasmática y lisosomal
Producción
- El transgen es colocado en una micropipeta de vidrio (0,1 micras de diámetro)
- Se pica la célula y se introduce la secuencia genética
Esta metodología requiere un equipo de ópticas y brazos mecánicos móviles (micromanipulador) y células aisladas
Ventajas y Desventajas
Procedimiento muy costoso
Alta eficiencia de trasnfección
Empleado en:
Usado tanto ex vivo como in vitro
Requiere de mucho equipo
In vitro es usado en embriónes
Eficiencia del 30%
- Organismos transgénicos
- Introducción de RNA antisentido
- Eficaz para introduccion de DNA en piel
Muy preciso
Proceso lento
https://www.wpiinc.com/blog/post/new-technology-for-microinjection
Producción:
- Colocar sobre la bala de metal (oro o tungsteno) el material genético
- Disparar el proyectil por medio de una descarga electrica o de gas (pistola de genes)
- El disparo podrá penetrar hasta 20 capas de células
Biobalística
Microproyectiles
Generalidades
Método de transferencia directa de genes en una célula que consiste en propulsar a enorme velocidad microesferas de metal cubiertas de ADN (bolas de oro o tungsteno de un micrón de diámetro) con la ayuda de un cañón de ADN, sobre las células que deben modificarse con el fin de cruzar su pared.
Mejoramientos:
- Modificaciones en parámetros biológicos (promotor, el preacondicionamiento osmótico y el manejo de las células después del bombardeo)
- En los parámetros físicos del proceso de bombardeo (dispositivo de aceleración de partículas y parámetros del acelerador)
Electroporación
Componentes
Empleado en:
- Protocolos de vacunacion
- Transformación de células vegetales
- Creación de plantas trasngénicas
- Pistóla de genes / cañón de DNA
- Balas de metal
- Transgen
Ventajas y Desventajas
Muerte celular
Empleado in vitro e in vivo (con pistola de genes)
Porcentaje de éxito variable
Fácil manejo
Sistema es costoso
Integraciones múltuples
Ahorro de pasos por dejar el transgen cerca del núcleo
Generalidades
Sonicación
Busca permeabilizar las membranas, mediante el aumento significativo de la conductividad eléctrica, causado por un campo eléctrico aplicado externamente. Las membranas, se desestabilizan originando una pérdida temporal de la permeabilidad produciendo poros reversibles, por los que se producen el paso de macromoléculas por parte de las células
Generalidades
Técnica que emplea ultrasonido con frecuencias superiores a 20 KHz, para generar permeabilidad en las membranas, mediante la inducción de poros transitorios, a través de los cuales, el ADN foráneo puede ingresar al interior de la célula vegetal.
Ventajas y Desventajas
Muerte celular
Células se pueden aislar y hacerles control de calidad
Producción:
Eficiencia baja y transitoria
Usado in vitro e in vivo
- La muestra se somete a ultrasonidos con frecuencias superiores a 20 KHz, en presencia del vector.
- La duración de la sonicación es inferior a 15 minutos,
Componentes:
Producción:
Solución: Emplear la Enzima Hialuronidasa: aumenta la eficacia.
- Preparar las células junto con el plasmido del transgén en un buffer
- Aplicar pulso electrico en el electroporador (200 v/cm)
- Devolver las células a las condiciones de cultivo
Ventajas y Desventajas
Componentes:
- Electroporador
- Vector
- Muestra
- Buffer
Incrementa permeabilidad
Usado en paredes vasculares, corazón y músculo
Mejoramientos:
Simplicidad
Bajo costo
- Nucleofección: Deposítan el plásmido en el núcleo; sirve para células difíciles mejorando la eficacioa de transferencia (90% en DNA y 99% en RNA)
- Se colcoan los parámetros específicamente para cada tipo celular
Generalidades
Aumento de la
presión hidrodinámica
Aprovecha la fuerza magnética ejercida sobre los vectores genéticos asociados a las partículas magnéticas para atraer los vectores hacia las células objetivo, e incluso dentro de ellas. De este modo, toda la dosis de vector aplicada se concentra en las células en pocos minutos, de modo que el 100% de las células entra en contacto con una dosis significativa de vector.
Generalidades
Esta estrategia permite la inyeccion de gran volúmen de ADN o el ARN a los tejidos lo que induce presión hidrodinámica y perforación de la membrana celular y, por lo tanto, la entrega de genes intracelulares mediante la entrada de fluidos.
Ventajas y Desventajas
Método sencillo y eficaz
Transfección en pocos minutos
Tamaño de partícula inferior a 50 nm problema en el direccionamiento magnéticoTamaño de partícula demasiado grande (más de 5 μm) retarda la entrada de nanopartículas magnéticas dentro de los capilares sanguíneos.
Ventajas y Desventajas
Por lo general, invasivo
Eficiencia baja y transitoria
Producción:
- Se agregan partículas catiónicas al plásmido.
- Se colocan ambos en un mismo buffer
- En la platina se coloca un impulso magnetico
- Con la fuerza se introduce el gen a la célula
Producción:
- Preparan de la solucn para ser inyectada
- Se deben inyectar 15–50 μg de ADN plasmídico.
- El volumen total de solución inyectada debe corresponder al 10% del peso corporal.
- Inyecciónintravascular de ADN hidrodinámico .
- Una vez que la inyección se realiza con éxito, se pasa a recuperación
- La extracción de tejido para preparar extractos de tejido debe realizarse 24 a 48 h después de la inyección.
- Una vez extraído, el tejido se enjuaga con PBS y se congela inmediatamente en nitrógeno líquido.
Magnetofección
DNA DESNUDO
Generalidades
Ocurre cuando se lleva a cabo la inyección directa de la parte codificadora a un tejido. En ella, el ADN es vehiculizado en una solución salina o sérica y normalmente administrado mediante inyección intramuscular
Producción:
- Introducción del DNA en una solución salina o sérica
- Inyeccion de la solución intramuscular
- El DNA es endocitado a traves del poro nuclear
Ventajas y Desventajas
Porcentaje bajo de transfeccióna
Usados para tejidos como el timo, piel, músculo, etc.
No se integra al genoma
Solo se emplea in vivo al inyectar el plásmido
Inducción de Fusión:
- Modificando el pH
- Mezclando con lípidos neutros
Vectores de Fusión
Tienen como objetivo modificar las propiedades de los propios ácidos nucleicos, promoviendo su asociación con moléculas capaces de reducir su hidrofilia y neutralizar su carga, lo que en última instancia conduce a
una mayor captación celular.
Liposomas
Generalidades
Son vesículas cerradas formadas por una o más bicapas lipídicas que rodean un núcleo. y ahora se utilizan ampliamente para transportar diferentes moléculas en una variedad de aplicaciones, desde la quimioterapia o antifúngico, las aplicaciones cosméticas.
Lípidos
Generalidades
- El DNA es introducido en el centro, con la finalidad de que se protega el daño y logre entrar en la célula con facilidad
- Cuando el DNA se encuntra dentro del liposoma se llama LIPOPLEX
Las moléculas lipídicas son insolubles en agua, pero se disuelven fácilmente en disolventes orgánicos. Los tres tipos principales de lípidos
de las membranas celulares son: los fosfolípidos (los
más abundantes), el colesterol y los glucolípidos. Los
tres son anfipáticos: tienen un extremo
hidrofílico («que se siente atraído por el
agua») y un extremo hidrofóbico (que
rehuye el agua»)
Ventajas
Variantes:
- Membranas biológicas
- Liposomas
TIPOS
Liberacion controlada
Desventajas
Simple manufactura
De Complejo
De encapsulamiento
Cristalización del tejido
Cinéticas muy variables
Clasificación de liposomas
Polímeros
Generalidades
Liposomas Aniónicos
- Hace lipoplex de empaquetamiento
- Membrana con carga negativa
Macromoléculas formadas por la unión de pequeñas moléculas llamadas monómeros.
Ventajas y Desventajas
- Llamados también: Liposomas-no-lípidos
- Complejo de DNA + Polímero: POLIPLEX
- Entra a la célula por atracción de cargas
Transporta fármacos sitio-específicos
Limitada capacidad para entrar al citosol
Polímeros más Usados:
POLI-ETILENO-GLICOL
POLI-L-LISINA
Producción
Liposomas Neutros
- Es un estabilizador estérico que aumrnta la biodisponibilida en sangre.
- Se fusionan con la membrana
- Unión del complejo (liposoma - DNA) por condensación de cargas
- Transporte hacia el blanco y unión
- Captura endocitica
- Liberación del complejo
- Descobertura del DNA
- Captura al interior nuclear
- Expresión del gen por gactores de transcripción
Ventajas
Mejoramiento:
- Adición de un promotor o receptor para hacerlo sitio-específico
- Unión con un lípido (policatión conjugado) para aumentar 100 veces más la eficiencia
Ayudan a construir lipoplex
Beneficios:
- Aumenta biocompatibilidad, baja toxicidad, poca inmunogenicidad, soluble en medio acuoso.
Liposomas Catiónicos
- Membrana con carga positiva
- Forman lipoplex de complejo
Ventajas y Desventajas
No puede liberar DNA dentro del citoplasma
Previene captura por el MPS
Aumenta el tiempo en el liposoma
Mejora la distribución
No permite que se formen agregados en los liposomas
Ventajas
Mejoramiento:
- Adicion de lípidos fusogénicos (DOPE)
- Variante: Virosomas para aumentar la eficiencia de fusión.
Dan reacciones electroestáticas
Permiten formación de particulas de 20-100 nm
Se condensan las cargas + y -
Vectores De Endocitosis
Generalidades
Moléculas que inducen el escape endosómico
La Endocitosis es un proceso que permite la entrada de grandes macromoléculas polares en las células gracias a la formación de vesículas de membrana en la superficie celular, seguida de su internalización y tráfico intracelular. Una vez internalizado el material dentro de las vesículas endosómicas aun no tienen acceso al interior de la célula, es decir, el espacio citosólico y los orgánulos como el núcleo, por lo que se requiere que la secuencia atraviese la membrana de los endosomas, ya sea por destrucción de la propia membrana o por paso físico, para poder escapar del endosoma temprano y lograr una entrega eficiente.
- Lípidos catiónicos / polímeros catiónicos
- Péptidos anfifílicos
- Agentes lisosomotrópicos
- DOPE
- 6His-CM18-PTD4
- LLOME (tóxico)
En los últimos años, se han descubierto varios mecanismos de endocitosis, que difeieren del tamaño de la vesícula formada y la maquinaria molecular implicada
Inmunoliposomas
Generalidades
En esta técnica complejos sintéticos están compuestos por un ligando dirigido específico de la célula, acoplado a un elemento de unión al ADN y una función endosmolítica. Estos complejos pueden entregar genes a las células de manera específica para el receptor, sin ninguna secuencia de ADN viral ni restricciones de empaquetamiento.
Generalidades
En la membrana del liposoma se agregan Anticuerpos para aumentar la especificidad.
Mecanismo de entrega
- Unión de ADN/vector
- Internalización
- Tráfico subcelular
- Escape vesicular
- Importación nuclear
- Desempaquetado para transcripción u otras funciones
Mecanismo de entrega
Componentes
Mejoras:
- Adicionarles moléculas fusogénicas para que escape del endosoma
- Agregar Sseñales de localizacion Nuclear para que llegue al núcelo
- Ligando del poliplex reconoce recepotres específicos
- El poliplex es endocitado
- Introducción del gen
- Liposoma catiónico
- Un fragmento de anticuerpo monocatenario
- PEG
Más usado para el empleo de fármacos como:
- Anfotericina B
- Docorrubicina
Funcion que brindan los Anticuerpos:
- Dirigir el liposoma al tejido
- Inducir la endocitosis
Ventajas y Desventajas
Problemas para escapar del liposoma
Es sitio-específico gracias a los Ac
Ventajas y Desventajas
Transferencia de genes exitosa
Problemas en llegar al núcleo
Mayor capacidad de carga del fármaco
Mediados por receptor
Reducción de la degradación del fármaco
Es sitio-específico gracias a los Ac
Dendrímeros
Generalidades
Los dendrímeros son macromoléculas poliméricas sintéticos con periferia de carga positiva y que está compuesto de múltiples brazos monoméricos característicos que definen la generación y el tamaño
Producción:
- Los dendrímeros generalmente se preparan utilizando un método divergente o uno convergente.
- (Divergente) el dendrímero crece hacia el exterior a partir de una molécula central multifuncional.
- La molécula central reacciona con moléculas de monómero que contienen un grupo reactivo y dos latentes, lo que da lugar al dendrímero de primera generación.
- Luego, la nueva periferia de la molécula se activa para reacciones con más monómeros.
Ventajas y Desventajas
Robusta construcción covalente
Mejoramientos:
Algunos como PAMAM muestran baja estabilidad durante la esterilización por calor,
Control de estructura y tamaño
- Uso de varios radicales para aumentar la biocompatibilidad.
- Diferentes estrategias de modulación estructural para reducir la citotoxicidad
Toxicidad baja tanto in vitro como in vivo
Mientras más grande la molécula mas toxicidad generará
Inhiben las nucleasas dependientes de pH
Componentes:
Presenta una transfección del 50%
Mientras más generaciones presente, mayor es la eficacia (Recognición multivalente)
OBJETIVO: Entrega del transgen (gen terapéutico) en el núcleo de la célula blanco por interacción específica con receptores celulares; mediado por endocitosis.
Vectores Virales
VECTORES VIRALES DE USO COMÚN
GENERALIDADES
PARA ELLO SE TOMA EN CUENTA:
Los vectores virales son partículas de virus no compemententes que han sido modificadas con la introducción de un transgen con el fin de generar una respuesta en el organismo. Para poderse multiplicar y llegar a la célula blanco, es necesario que el vector viral tenga secuencias de regulación en el transgen, además de señales de replicación y empaquetamiento. El principal problema de los vectores virales frente a los no virales es su poca capacidad de empaquetamiento.
* RETROVIRUS: * ADENOVIRUS: * ADENOASOCIADOS:
- TROPISMO: Rango de transfección y especificidad del mismo.
- REPLICACIÓN: No generación de partículas competentes.
- TRANSGEN: Elementos regulatorios necesarios para lograr el efecto terapéutico deseado.
- VÍA DE TRANSMISIÓN: Elección de la mejor vía de administración para evitar la degradación y lograr estabilidad.
Vector gammaretroviral
Método de Producción
Precipitación con Fosfato de Calcio
Basados en virus de Leucemia murina Mo-MLV
1. Generación del vector con el transgen para transfectar a célula empaquetadora. El vector del transgen contiene señal empaquetadora. 2. En la célula empaquetadora se expresa
los genes gag, pol y env. Se recomienda una transfección estable para armado inmediato de la partícula 3. El vector solo es capaz de tener un solo
ciclo de infección.
GENOMA VIRAL
VECTOR DEL TRANSGEN
Para la célula empaquetadora:
¿Qué elementos se conservan?
- Señal de empaquetamiento.
- PPT: Sitio de polipurinas.
- Es un cultivo donde se expresan las proteínas virales para propagar al vector.
- Generalmente se emplean células de murino (Mo-MLV tiene dos variantes de proteínas de superficie)
- LTRs (U3 R U5).
- PBS: Transcripción inversa.
- SA y SD: Sitios de Splice.
EMPAQUETAN 8 KB
Proteínas variantes de Mo-MLV:
VARIANTES DEL VECTOR:
TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS MURINAS: Rec-1.TRANSFECCIÓN DIVERSAS ESPECIES: Ram-1. Para transfectar células no murinas es necesario realizar una selección de paso doble para quitar Rec-1 y poner Ram-1; para ello se hace una selección exotrópica seguida de una selección amfotrópica.
Con promotor interno: Delección de los sitios de Splice.
Dos genes: Flanqueo por los sitios de Splice.
Dos genes con promotor interno: Sin sitios de Splice.
Con secuencia de reconocimiento ribosomal (IRES).
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
PRINCIPAL PROBLEMÁTICA:
Gracias a su degradación e integración al DNA blnaco se buscan nuevas formas de producción. Además tienen una BAJA concentración de producción.SOLUCIÓN: Al incluir el gen neo dentro de las 8kb se alcanzan concentraciones mayores.
Capacidad de empaquetamiento.Solo uso ex vivo. Solo células en división. Mutagenésis en sitios pro-oncogénicos.
De uso simple y alta eficacia.Integración al genoma. Expresión permanente (o semipermanente)
Vector lentiviral
PRODUCCIÓN:Se necesitan 3 plásmidos (1 vector de transgén y 2 vectores de empaquetamiento). Los de empaquetamiento necesitan un promotor fuerte y el tercer plásmido se hace con el virus de estomatitis vesicular.
Basados en virus HIV-1
La diferencia entre el serotipo 1 y 2 del HIV es solamente un gen accesorio.
GENOMA VIRAL
De empaquetamiento:
2do Vector de empaquetamiento:Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing.
Secuencia de VSV-G y PolyA.
1er Vector de empaquetamiento:Deletar LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing.
Y se mantienen los 9 genes del HIV-1.
PRIMERA GENERACIÓN:
Del transgen:
1. Los 3 plásmidos se transfectan en la célula empaquetadora (HEK293) donde se generan las partículas lentivirales. NOTA: Con la primera generación de lentivirales hay un riesgo muy fuerte de creación de lentivirus competente.
- Señal de empaquetamiento.
- PPT: Sitio de polipurinas.
- Promotor: No empaquetadora.
¿Qué elementos se conservan?
- LTRs (U3 R U5).
- PBS: Unión del primer.
- SA y SD: Sitios de Splice.
EMPAQUETAN 8 KB
De empaquetamiento:
SEGUNDA GENERACIÓN:
Del transgen:
2do Vector de empaquetamiento:Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing.
Secuencia de VSV-G y PolyA.
1er Vector de empaquetamiento:Deletar LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing.Se le quitan los genes accesorios de HIV-1 (nef, ref, vpu y vpr).
¿Qué elementos se conservan?
- Señal de empaquetamiento.
- PPT: Sitio de polipurinas.
- Promotor: No empaquetadora.
TERCERA GENERACIÓN:
- LTRs (U3 R U5).
- PBS: Unión del primer.
- SA y SD: Sitios de Splice.
Del transgen:
EMPAQUETAN 8 KB
PRODUCCIÓN:Se necesitan 3 plásmidos (1 vector de transgén y 2 vectores de empaquetamiento). Los de empaquetamiento necesitan un promotor fuerte y el tercer plásmido se hace con el virus de estomatitis vesicular.
- Señal de empaquetamiento.
- PPT: Sitio de polipurinas.
- Promotor: No empaquetadora.
¿Qué elementos se conservan?
- LTRs (R U5). Sin U3.
- PBS: Unión del primer.
- SA y SD: Sitios de Splice.
EMPAQUETAN 8 KB
PRODUCCIÓN:Se necesitan 4 plásmidos (1 vector de transgén y 3 vectores de empaquetamiento). Se utilizan los promotores de RSV y CMV.
Vector adenoviral
De empaquetamiento:
Al trabajar con adenovirus se debe considerar:
- Su genoma tiene genes tempranos y tardíos.
- Son los vectores más inmunogénicos; se tienen respuestas FUERTES.
- Responsables de resfriados, gastritis y conjuntivitis.
1er Vector de empaquetamiento:Deletar LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Solo gag, env y pol.
GENOMA: Molécula de DNA líneal de doble cadena (36kb) que lleva a los extremos dos secuencias idénticas inversas (ITRs).
3er Vector de empaquetamiento:Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing.
Secuencia de VSV-G y PolyA.
2do Vector de empaquetamiento:Añadir promotor SRV. Se añade gen rev de HIV-1 y PolyA.
Los genes tempranos se denominan con la letra E y los genes tardíos con la letra L, los primeros son para replicación y los segundos para el ensamblaje.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
Capacidad de transfectar células en no división por cruce de membrana nuclear.Se puede utilizar in vivo.
Generación de partículas competentes.Mutagénisis por integración aleatoria de LTRs.
PRINCIPAL PROBLEMÁTICA:
Gracias a su degradación e integración al DNA blnaco se buscan nuevas formas de producción. Además tienen una BAJA concentración de producción.SOLUCIÓN: Al incluir el gen neo dentro de las 8kb se alcanzan concentraciones mayores.
E1 DEBE DELETARSE PORQUE INTERACTÚA CON P53 (ONCOGÉNESIS)
PRIMERA GENERACIÓN:
Del transgen:
- Aumeto en la capacidad replicativa.
- Menor eficacia de transfección.
ESTRUCTURA:
- ITRs.
- Señal de empaquetamiento.
- Remoción de E1 y/o E3.
- Promotor.
- Sitio de Poliadenilación.
GUTLESS:
Del transgen:
ESTRUCTURA:
- ITRs.
- Señal de empaquetamiento.
- Remoción de TODOS los genes.
- Promotor y Poliadenilación.
- DNA sin relevancia.
Al deletar E1 empacan 5.1kb y al deletar E1 y E3 8kb.
- Tienen replicación deficiente in vivo.
- Fuerte Respuesta Inflamatoria.
- Ad2 y Ad5 son los más utilizados.
Empaquetamiento de hasta 37kb.
SEGUNDA GENERACIÓN:
- Se necesita un virus HELPER para su empaquetamiento y producción.
- Se puede contener solo un gen o múltiples genes.
Del transgen:
ESTRUCTURA:
- ITRs.
- Señal de empaquetamiento.
- Remoción de E1, E2, E3 Y E4.
- Promotor.
- Sitio de Poliadenilación.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
Transfección eficiente. Alta producción de partículas. Transfección en células en división y no división.
Generación de partículas competentes. Oncogénicos.Respuesta inmune e inflamatoria. Transfección transitoria.
Empaquetamiento de hasta 14kb.
PRODUCCIÓN:
Sistema de Recombinación Cre-loxP.
Recombinación en células HELPER (1ra y 2da generación)
Se basa en la recombinación seguida de amplificación en bacteria.1. Se utiliza un plásmido que contiene al gen terapéutico flanqueado por loxP y un plásmido que contiene el genoma adenoviral.2. Se realiza la recombinación gracias a la enzima Cre-recombinasa. 3. Se transforman las bacterias con el plásmido recombinante. 4. Se transfectan las células HEK293.
1. Se utilizan células HEK293 con DNA de Ad5 que tiene deletada la región ITR5´-Empaquetamiento-E1.2. Se transfecta un plásmido que contiene región ITR5´-Empaquetamiento-Promotor-Transgen-PolyA. 3. Gracias a una recombinación dentro de la célula Helper los fragmentos se unen para tener la secuencia flanqueada por ITRs.
PRODUCCIÓN GUTLESS:
Vector adenoasociado
Sistema de Recimbinación de Cre-loxP en células HEK293Cre.
Al trabajar con virus adenoasociados se debe considerar:
- Se nenecesita de un helper para que se pueda formar la partícula viral, de lo contrario se queda en estado latente.
- NO siempre es otro virus, también pueden helpers fisícos/químicos.
- Tienen una capacidad de empaquetamiento menor a todos los vectores virales anteriormente mencionados.
1. Se utiliza el vector Gutless y un Helper virus que tiene deleción de E1 y tiene flanqueado el sitio de recombinación por loxP. 2. Se insertan en células HEK293Cre que ya cuentan con cre-recombinasa, por lo tanto al entrar a la célula hay corte en el flanqueo de loxP. 3. El corte en el sitio de recombinación promueve la fusión de Gutless con helper virus.
- La selección del AAV a utilizar será en función del tropismo del serotipo.
- AAV2 es el más utilizado.
4. Se forman partículas virales NO competentes que contienen el transgen.
- Mosaico de Cápside
- Administrarle PEG para una mayor biodisponibilidad
Mejoramiento
Del transgen:
GENOMA: Es una molécula simple que contiene DNA de cadena sencilla y además esta flánqueado con ITRs. Los genes más importantes son:
- rep: Familia de proteínas para la replicación.
- cap: Familia de proteínas para la estructura viral.
ITR
Empacan solo 5kb
ESTRUCTURA:
- Poliadenilación
- Se deletan TODOS los genes.
PRODUCCIÓN:
1. Se utiliza un plásmido que contiene al vector del transgen y otro plásmido que contiene rep y cap además de el genoma de un virus helper.2. Se realiza la transfección el células HEK293 gracias a la técnica de fosfato de Calcio. 3. Una vez que se tienen a las células transfectadas se realiza una lisis celular para poder purificar a las partículas adenoasociadas. 4. La purificación se realiza con cloruro de Celsio y centrifugaciones. 5. Es necesario caracterizar la muestra para no tomar partículas del virus HELPER.
EL PROMOTOR DISPUESTO ENTRE EL GEN REP Y CAP ES EL ENCARGADO DE LA REGULACIÓN DEL VIRUS.
- Mosaico de Cápside
- Administrarle PEG para una mayor biodisponibilidad
Mejoramiento
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
Baja respuesta inmunitaria. Expresión NO integrativa. No hay interferencia por promotores. AAV con tropismo celular.
Se tiene que la mayor parte de la población (80%) tiene una preinmunidad con algun serotipo de AAV (se puede dar la eliminación del transgen).
- Abbasi, E., Aval, S. F., Akbarzadeh, A., Milani, M., Nasrabadi, H. T., Joo, S. W., Hanifehpour, Y., Nejati-Koshki, K., & Pashaei-Asl, R. (2014). Dendrimers: synthesis, applications, and properties. Nanoscale research letters, 9(1), 247. https://doi.org/10.1186/1556-276X-9-247
- Brock, D. J., Kondow-McConaghy, H. M., Hager, E. C., & Pellois, J. P. (2019). Endosomal Escape and Cytosolic Penetration of Macromolecules Mediated by Synthetic Delivery Agents. Bioconjugate chemistry, 30(2), 293–304. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.8b00799
- Chis, A. A., Dobrea, C. M., Rus, L. L., Frum, A., Morgovan, C., Butuca, A., Totan, M., Juncan, A. M., Gligor, F. G., & Arseniu, A. M. (2021). Dendrimers as Non-Viral Vectors in Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy. Molecules (Basel, Switzerland), 26(19), 5976. https://doi.org/10.3390/molecules26195976
- Deonarain , P. (2005) Ligand-targeted receptor-mediated vectors for gene delivery. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 8:1, 53-69, DOI: 10.1517/13543776.8.1.53
- Kingston, E., Chen, C. y Rosa, J. (2003) Calcium Phosphate Transfection. Current protocols in molecular biology. DOI: 10.1002/0471142727.mb0901s63
- Russell, J. A., Roy, M. K., & Sanford, J. C. (1992). Major Improvements in Biolistic Transformation of Suspension-Cultured Tobacco Cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Plant, 28P(2), 97–105. http://www.jstor.org/stable/20064823
VECTORES: Terapia Génica 483
Luis Armando Valenzuela
Created on April 5, 2022
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Transcript
Universidad Autónoma de Nuevo LeónFacultad de Ciencias Biológicas Licenciado en Biotecnología Genómica
VECTORES VIRALES & NO VIRLAES
DossierTerapia Génica
Dra. Brenda González Hernández
Gpo: 483
Matrícula
Alumnos
1846329 1941187
Pérez Escamilla ValeriaValenzuela Ahumada Luis Armando
Indice
06
04
03
05
Métodos Físicos
Biobalística / Electroporación
Vectores Químicos
Vectores
Métodos Físicos
Transferencia con fosfato de calcio
Vectores No Virales
Microinyección
07
08
09
10
De Fusión
Métodos Físicos
Métodos Físicos
DNA desnudo
Métodos Físicos
Liposomas
Sonicación
Aumento de presión Hidráulica
12
13
11
14
De Endocitosis
De Endocitosis
De Endocitosis
De Fusión
Dendrímeros
Inmunoliposomas / Mediados por receptor
Polímeros
20
16
15
18
Vectores virales
Vectores virales
Vectores virales
Vectores virales
Lentivirus / Adenovirus
Lentivirus
Gammaretrovirus
26
23
25
Bibliografía
Vectores virales
Cuadro Comparativo
AAV
VECTORES
Son vehículos que transportan el material genético a una amplia variedad de células, tejidos y órganos completos.
El vector óptimo y el sistema de entrega dependen de:
- Las células diana y sus características
- La duración de la expresión
- El tamaño del material genético que se incorporará en el vector .
Los vectores utilizados para la terapia génica son muy variados, pero actualmente se clasifican en términos generales como vectores virales y vectores no viralesVectores no Virales
Ventajas
Generalidades
Relativa seguridadCapacidad para transferir genes grandesEspecificidad de sitioPropiedades no inflamatorias, no tóxicas y no infecciosas.
Mientras que los vectores virales son capaces de producir una alta eficiencia de transfección, las complicaciones de seguridad empujan las investigaciones hacia el campo de los vectores no virales; Estos son ADN desnudo, basados en partículas y químicos. Se dividen en 4 categorias:
Desventajas
Baja eficiencia de transfecciónExpresión transgénica relativamente pobre
Producción
Vectores Quimicos
Transferencia con fosfato de calcio
Generalidades
La utilización del fosfato de calcio se basa en la capacidad que presentan los iones calcio para precipitar el ADN provocando que la célula, mediante endocitosis, introduzca el ADN en su interior.
Ventajas y Desventajas
Económico
No es tóxica
Mejoramiento
Eficiencia del 10%
Expresión del gen transitoria
Su utilización se ve reducida a cultivos celulares en aplicaciones ex vivo.
Problemas en llegar al núcleo
Mejoramientos
Vectores Fisicos
Bombas de inyección
Penetrador de células milimétricas
Microinyección
Generalidades
Técnica donde el ADN es introducido por inyección directamente en el núcleo de las células gracias a la ayuda de un micromanipulador, evitando de este modo la degradación citoplasmática y lisosomal
Producción
- El transgen es colocado en una micropipeta de vidrio (0,1 micras de diámetro)
- Se pica la célula y se introduce la secuencia genética
Esta metodología requiere un equipo de ópticas y brazos mecánicos móviles (micromanipulador) y células aisladasVentajas y Desventajas
Procedimiento muy costoso
Alta eficiencia de trasnfección
Empleado en:
Usado tanto ex vivo como in vitro
Requiere de mucho equipo
In vitro es usado en embriónes
Eficiencia del 30%
Muy preciso
Proceso lento
https://www.wpiinc.com/blog/post/new-technology-for-microinjection
Producción:
Biobalística
Microproyectiles
Generalidades
Método de transferencia directa de genes en una célula que consiste en propulsar a enorme velocidad microesferas de metal cubiertas de ADN (bolas de oro o tungsteno de un micrón de diámetro) con la ayuda de un cañón de ADN, sobre las células que deben modificarse con el fin de cruzar su pared.
Mejoramientos:
Electroporación
Componentes
Empleado en:
Ventajas y Desventajas
Muerte celular
Empleado in vitro e in vivo (con pistola de genes)
Porcentaje de éxito variable
Fácil manejo
Sistema es costoso
Integraciones múltuples
Ahorro de pasos por dejar el transgen cerca del núcleo
Generalidades
Sonicación
Busca permeabilizar las membranas, mediante el aumento significativo de la conductividad eléctrica, causado por un campo eléctrico aplicado externamente. Las membranas, se desestabilizan originando una pérdida temporal de la permeabilidad produciendo poros reversibles, por los que se producen el paso de macromoléculas por parte de las células
Generalidades
Técnica que emplea ultrasonido con frecuencias superiores a 20 KHz, para generar permeabilidad en las membranas, mediante la inducción de poros transitorios, a través de los cuales, el ADN foráneo puede ingresar al interior de la célula vegetal.
Ventajas y Desventajas
Muerte celular
Células se pueden aislar y hacerles control de calidad
Producción:
Eficiencia baja y transitoria
Usado in vitro e in vivo
Componentes:
Producción:
Solución: Emplear la Enzima Hialuronidasa: aumenta la eficacia.
Ventajas y Desventajas
Componentes:
Incrementa permeabilidad
Usado en paredes vasculares, corazón y músculo
Mejoramientos:
Simplicidad
Bajo costo
Generalidades
Aumento de la presión hidrodinámica
Aprovecha la fuerza magnética ejercida sobre los vectores genéticos asociados a las partículas magnéticas para atraer los vectores hacia las células objetivo, e incluso dentro de ellas. De este modo, toda la dosis de vector aplicada se concentra en las células en pocos minutos, de modo que el 100% de las células entra en contacto con una dosis significativa de vector.
Generalidades
Esta estrategia permite la inyeccion de gran volúmen de ADN o el ARN a los tejidos lo que induce presión hidrodinámica y perforación de la membrana celular y, por lo tanto, la entrega de genes intracelulares mediante la entrada de fluidos.
Ventajas y Desventajas
Método sencillo y eficaz
Transfección en pocos minutos
Tamaño de partícula inferior a 50 nm problema en el direccionamiento magnéticoTamaño de partícula demasiado grande (más de 5 μm) retarda la entrada de nanopartículas magnéticas dentro de los capilares sanguíneos.
Ventajas y Desventajas
Por lo general, invasivo
Eficiencia baja y transitoria
Producción:
Producción:
Magnetofección
DNA DESNUDO
Generalidades
Ocurre cuando se lleva a cabo la inyección directa de la parte codificadora a un tejido. En ella, el ADN es vehiculizado en una solución salina o sérica y normalmente administrado mediante inyección intramuscular
Producción:
Ventajas y Desventajas
Porcentaje bajo de transfeccióna
Usados para tejidos como el timo, piel, músculo, etc.
No se integra al genoma
Solo se emplea in vivo al inyectar el plásmido
Inducción de Fusión:
Vectores de Fusión
Tienen como objetivo modificar las propiedades de los propios ácidos nucleicos, promoviendo su asociación con moléculas capaces de reducir su hidrofilia y neutralizar su carga, lo que en última instancia conduce a una mayor captación celular.
Liposomas
Generalidades
Son vesículas cerradas formadas por una o más bicapas lipídicas que rodean un núcleo. y ahora se utilizan ampliamente para transportar diferentes moléculas en una variedad de aplicaciones, desde la quimioterapia o antifúngico, las aplicaciones cosméticas.
Lípidos
Generalidades
Las moléculas lipídicas son insolubles en agua, pero se disuelven fácilmente en disolventes orgánicos. Los tres tipos principales de lípidos de las membranas celulares son: los fosfolípidos (los más abundantes), el colesterol y los glucolípidos. Los tres son anfipáticos: tienen un extremo hidrofílico («que se siente atraído por el agua») y un extremo hidrofóbico (que rehuye el agua»)
Ventajas
Variantes:
TIPOS
Liberacion controlada
Desventajas
Simple manufactura
De Complejo
De encapsulamiento
Cristalización del tejido
Cinéticas muy variables
Clasificación de liposomas
Polímeros
Generalidades
Liposomas Aniónicos
Macromoléculas formadas por la unión de pequeñas moléculas llamadas monómeros.
Ventajas y Desventajas
Transporta fármacos sitio-específicos
Limitada capacidad para entrar al citosol
Polímeros más Usados:
POLI-ETILENO-GLICOL
POLI-L-LISINA
Producción
Liposomas Neutros
Ventajas
Mejoramiento:
Ayudan a construir lipoplex
Beneficios:
Liposomas Catiónicos
Ventajas y Desventajas
No puede liberar DNA dentro del citoplasma
Previene captura por el MPS
Aumenta el tiempo en el liposoma
Mejora la distribución
No permite que se formen agregados en los liposomas
Ventajas
Mejoramiento:
Dan reacciones electroestáticas
Permiten formación de particulas de 20-100 nm
Se condensan las cargas + y -
Vectores De Endocitosis
Generalidades
Moléculas que inducen el escape endosómico
La Endocitosis es un proceso que permite la entrada de grandes macromoléculas polares en las células gracias a la formación de vesículas de membrana en la superficie celular, seguida de su internalización y tráfico intracelular. Una vez internalizado el material dentro de las vesículas endosómicas aun no tienen acceso al interior de la célula, es decir, el espacio citosólico y los orgánulos como el núcleo, por lo que se requiere que la secuencia atraviese la membrana de los endosomas, ya sea por destrucción de la propia membrana o por paso físico, para poder escapar del endosoma temprano y lograr una entrega eficiente.
En los últimos años, se han descubierto varios mecanismos de endocitosis, que difeieren del tamaño de la vesícula formada y la maquinaria molecular implicada
Inmunoliposomas
Generalidades
En esta técnica complejos sintéticos están compuestos por un ligando dirigido específico de la célula, acoplado a un elemento de unión al ADN y una función endosmolítica. Estos complejos pueden entregar genes a las células de manera específica para el receptor, sin ninguna secuencia de ADN viral ni restricciones de empaquetamiento.
Generalidades
En la membrana del liposoma se agregan Anticuerpos para aumentar la especificidad.
Mecanismo de entrega
Mecanismo de entrega
Componentes
Mejoras:
Más usado para el empleo de fármacos como:
Funcion que brindan los Anticuerpos:
Ventajas y Desventajas
Problemas para escapar del liposoma
Es sitio-específico gracias a los Ac
Ventajas y Desventajas
Transferencia de genes exitosa
Problemas en llegar al núcleo
Mayor capacidad de carga del fármaco
Mediados por receptor
Reducción de la degradación del fármaco
Es sitio-específico gracias a los Ac
Dendrímeros
Generalidades
Los dendrímeros son macromoléculas poliméricas sintéticos con periferia de carga positiva y que está compuesto de múltiples brazos monoméricos característicos que definen la generación y el tamaño
Producción:
Ventajas y Desventajas
Robusta construcción covalente
Mejoramientos:
Algunos como PAMAM muestran baja estabilidad durante la esterilización por calor,
Control de estructura y tamaño
Toxicidad baja tanto in vitro como in vivo
Mientras más grande la molécula mas toxicidad generará
Inhiben las nucleasas dependientes de pH
Componentes:
Presenta una transfección del 50%
Mientras más generaciones presente, mayor es la eficacia (Recognición multivalente)
OBJETIVO: Entrega del transgen (gen terapéutico) en el núcleo de la célula blanco por interacción específica con receptores celulares; mediado por endocitosis.
Vectores Virales
VECTORES VIRALES DE USO COMÚN
GENERALIDADES
PARA ELLO SE TOMA EN CUENTA:
Los vectores virales son partículas de virus no compemententes que han sido modificadas con la introducción de un transgen con el fin de generar una respuesta en el organismo. Para poderse multiplicar y llegar a la célula blanco, es necesario que el vector viral tenga secuencias de regulación en el transgen, además de señales de replicación y empaquetamiento. El principal problema de los vectores virales frente a los no virales es su poca capacidad de empaquetamiento.
* RETROVIRUS: * ADENOVIRUS: * ADENOASOCIADOS:
Vector gammaretroviral
Método de Producción
Precipitación con Fosfato de Calcio
Basados en virus de Leucemia murina Mo-MLV
1. Generación del vector con el transgen para transfectar a célula empaquetadora. El vector del transgen contiene señal empaquetadora. 2. En la célula empaquetadora se expresa los genes gag, pol y env. Se recomienda una transfección estable para armado inmediato de la partícula 3. El vector solo es capaz de tener un solo ciclo de infección.
GENOMA VIRAL
VECTOR DEL TRANSGEN
Para la célula empaquetadora:
¿Qué elementos se conservan?
EMPAQUETAN 8 KB
Proteínas variantes de Mo-MLV:
VARIANTES DEL VECTOR:
TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS MURINAS: Rec-1.TRANSFECCIÓN DIVERSAS ESPECIES: Ram-1. Para transfectar células no murinas es necesario realizar una selección de paso doble para quitar Rec-1 y poner Ram-1; para ello se hace una selección exotrópica seguida de una selección amfotrópica.
Con promotor interno: Delección de los sitios de Splice.
Dos genes: Flanqueo por los sitios de Splice.
Dos genes con promotor interno: Sin sitios de Splice.
Con secuencia de reconocimiento ribosomal (IRES).
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
PRINCIPAL PROBLEMÁTICA:
Gracias a su degradación e integración al DNA blnaco se buscan nuevas formas de producción. Además tienen una BAJA concentración de producción.SOLUCIÓN: Al incluir el gen neo dentro de las 8kb se alcanzan concentraciones mayores.
Capacidad de empaquetamiento.Solo uso ex vivo. Solo células en división. Mutagenésis en sitios pro-oncogénicos.
De uso simple y alta eficacia.Integración al genoma. Expresión permanente (o semipermanente)
Vector lentiviral
PRODUCCIÓN:Se necesitan 3 plásmidos (1 vector de transgén y 2 vectores de empaquetamiento). Los de empaquetamiento necesitan un promotor fuerte y el tercer plásmido se hace con el virus de estomatitis vesicular.
Basados en virus HIV-1
La diferencia entre el serotipo 1 y 2 del HIV es solamente un gen accesorio.
GENOMA VIRAL
De empaquetamiento:
2do Vector de empaquetamiento:Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Secuencia de VSV-G y PolyA.
1er Vector de empaquetamiento:Deletar LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Y se mantienen los 9 genes del HIV-1.
PRIMERA GENERACIÓN:
Del transgen:
1. Los 3 plásmidos se transfectan en la célula empaquetadora (HEK293) donde se generan las partículas lentivirales. NOTA: Con la primera generación de lentivirales hay un riesgo muy fuerte de creación de lentivirus competente.
¿Qué elementos se conservan?
EMPAQUETAN 8 KB
De empaquetamiento:
SEGUNDA GENERACIÓN:
Del transgen:
2do Vector de empaquetamiento:Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Secuencia de VSV-G y PolyA.
1er Vector de empaquetamiento:Deletar LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing.Se le quitan los genes accesorios de HIV-1 (nef, ref, vpu y vpr).
¿Qué elementos se conservan?
TERCERA GENERACIÓN:
Del transgen:
EMPAQUETAN 8 KB
PRODUCCIÓN:Se necesitan 3 plásmidos (1 vector de transgén y 2 vectores de empaquetamiento). Los de empaquetamiento necesitan un promotor fuerte y el tercer plásmido se hace con el virus de estomatitis vesicular.
¿Qué elementos se conservan?
EMPAQUETAN 8 KB
PRODUCCIÓN:Se necesitan 4 plásmidos (1 vector de transgén y 3 vectores de empaquetamiento). Se utilizan los promotores de RSV y CMV.
Vector adenoviral
De empaquetamiento:
Al trabajar con adenovirus se debe considerar:
1er Vector de empaquetamiento:Deletar LTRs y añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Solo gag, env y pol.
GENOMA: Molécula de DNA líneal de doble cadena (36kb) que lleva a los extremos dos secuencias idénticas inversas (ITRs).
3er Vector de empaquetamiento:Añadir promotor CMV. Se mantiene los sitios de splicing. Secuencia de VSV-G y PolyA.
2do Vector de empaquetamiento:Añadir promotor SRV. Se añade gen rev de HIV-1 y PolyA.
Los genes tempranos se denominan con la letra E y los genes tardíos con la letra L, los primeros son para replicación y los segundos para el ensamblaje.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
Capacidad de transfectar células en no división por cruce de membrana nuclear.Se puede utilizar in vivo.
Generación de partículas competentes.Mutagénisis por integración aleatoria de LTRs.
PRINCIPAL PROBLEMÁTICA:
Gracias a su degradación e integración al DNA blnaco se buscan nuevas formas de producción. Además tienen una BAJA concentración de producción.SOLUCIÓN: Al incluir el gen neo dentro de las 8kb se alcanzan concentraciones mayores.
E1 DEBE DELETARSE PORQUE INTERACTÚA CON P53 (ONCOGÉNESIS)
PRIMERA GENERACIÓN:
Del transgen:
ESTRUCTURA:
GUTLESS:
Del transgen:
ESTRUCTURA:
Al deletar E1 empacan 5.1kb y al deletar E1 y E3 8kb.
Empaquetamiento de hasta 37kb.
SEGUNDA GENERACIÓN:
Del transgen:
ESTRUCTURA:
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
Transfección eficiente. Alta producción de partículas. Transfección en células en división y no división.
Generación de partículas competentes. Oncogénicos.Respuesta inmune e inflamatoria. Transfección transitoria.
Empaquetamiento de hasta 14kb.
PRODUCCIÓN:
Sistema de Recombinación Cre-loxP.
Recombinación en células HELPER (1ra y 2da generación)
Se basa en la recombinación seguida de amplificación en bacteria.1. Se utiliza un plásmido que contiene al gen terapéutico flanqueado por loxP y un plásmido que contiene el genoma adenoviral.2. Se realiza la recombinación gracias a la enzima Cre-recombinasa. 3. Se transforman las bacterias con el plásmido recombinante. 4. Se transfectan las células HEK293.
1. Se utilizan células HEK293 con DNA de Ad5 que tiene deletada la región ITR5´-Empaquetamiento-E1.2. Se transfecta un plásmido que contiene región ITR5´-Empaquetamiento-Promotor-Transgen-PolyA. 3. Gracias a una recombinación dentro de la célula Helper los fragmentos se unen para tener la secuencia flanqueada por ITRs.
PRODUCCIÓN GUTLESS:
Vector adenoasociado
Sistema de Recimbinación de Cre-loxP en células HEK293Cre.
Al trabajar con virus adenoasociados se debe considerar:
1. Se utiliza el vector Gutless y un Helper virus que tiene deleción de E1 y tiene flanqueado el sitio de recombinación por loxP. 2. Se insertan en células HEK293Cre que ya cuentan con cre-recombinasa, por lo tanto al entrar a la célula hay corte en el flanqueo de loxP. 3. El corte en el sitio de recombinación promueve la fusión de Gutless con helper virus.
4. Se forman partículas virales NO competentes que contienen el transgen.
Mejoramiento
Del transgen:
GENOMA: Es una molécula simple que contiene DNA de cadena sencilla y además esta flánqueado con ITRs. Los genes más importantes son:
ITR
Empacan solo 5kb
ESTRUCTURA:
PRODUCCIÓN:
1. Se utiliza un plásmido que contiene al vector del transgen y otro plásmido que contiene rep y cap además de el genoma de un virus helper.2. Se realiza la transfección el células HEK293 gracias a la técnica de fosfato de Calcio. 3. Una vez que se tienen a las células transfectadas se realiza una lisis celular para poder purificar a las partículas adenoasociadas. 4. La purificación se realiza con cloruro de Celsio y centrifugaciones. 5. Es necesario caracterizar la muestra para no tomar partículas del virus HELPER.
EL PROMOTOR DISPUESTO ENTRE EL GEN REP Y CAP ES EL ENCARGADO DE LA REGULACIÓN DEL VIRUS.
Mejoramiento
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
Baja respuesta inmunitaria. Expresión NO integrativa. No hay interferencia por promotores. AAV con tropismo celular.
Se tiene que la mayor parte de la población (80%) tiene una preinmunidad con algun serotipo de AAV (se puede dar la eliminación del transgen).