TRABAJO TEMA 5

Aplicación de técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicaS

Realizado por: Irene Ruedas Díaz María Peláez Garrido Inés Serrano Farraces

ÍNDICE

1. Polisacáridos complejos

2. Reacciones histoquímicas basadas en la demostración de grupos carbonilo sobre los hidratos de carbono por oxidación previa

3. Control con la técnica del PAS-Diastasa

4. Técnica de la plata metenamina

5. Reacciones generales para determinar mucopolisacáridos ÁCIDOS

6. Generalidades sobre técnicas Histoquímicas de metacromasia

7. Técnica para diferenciar mucopolisacáridos neutros, carboximucopolisacáridos, sulfomucopolisacáridos y glucoproteínas

8. Histoquímica de las proteínas

9. Método histoquímico para la coloración de proteínas

10. Histoquímica de los ácidos nucleicos

11. Técnica para la distinción de ADN y ARN

12. Método para la detección de aminas biógenas y reacción cromafín

POLISACÁRIDOS COMPLEJOS

MUCOPOLISACÁRDIOS NEUTROS

En el epitelio gástrico, glandulas de Bruner (producen células =mucopolisacaridos)

mucopolisacáridos ácidos

- No sulfatados: Carboximucopolisacraidos epiteliales (vías respiratprias) Carboximucopolisacáridos conjuntivos (tejido conjuntivo laxo)

MUCOPROTEÍNAS

Células beta de la hipófisis, membranas basales, reticulina, colágena...

- Sulfatados:Sulfomucopolisacáridos epiteliales (glándulas submandibulares) Sulfomucopolisacáridos conjuntivos (cartílago hialino, piel..)

mucolípidos

Mezcla de lípidos complejos y polisacáridos

reacciones histoquímicas basadas en la demostración de grupos carbonilo sobre los hidratos de carbono por oxidación previa

REACCIÓN dE PAS

FUNDAMENTO DE L A REACCIÓN DEL PAS

Amplia aplicación diagnóstico histopatológico rutinario.

El ácido peryódico rompe enlaces haciendo que aparezcan 2 grupos aldehído (1,2 glicerol), estando muy juntos, esto ayudará a que el reactivo de Shicff pueda unirse y crear nuevos enlaces de Hidrogeno, haciendo que se convierta en cromógeno y aparezca color.

Colorear numerosos componentes bioquímicos (hidratos de carbono o sustancias relacionas con ellos.

REACTIVO DE SCHIFF

Se obtiene apartir de la fucsina básica. es tratada con ácido sulfuroso. Cuando este reaccciona con dos grupos aldehído contiguos flaqueados por los radicales OH, aparece de nuevo el doble enlace (grupo cromóforo), y con él,la coloración rojo fucsia característica. Ambos grupos aldehídos tiene que tener una distancia de 1 o 1,1 nm,

Siendo una reacción poco especifíca, puede convertirse en enormemente selectiva mediante los correspondinetes controles.

COMPUESTOS CON PAS (+)

1. Polisacáridos simples. 2. Mucopolisacáridos neutros. 3. mucoproteínas. 4. glucoproteínas del suero, membrana basal y fibras de reticulina. 5. glucolípidos.

COLORACIONES DE CONTRASTE

Resultado débilmente positivo: - contraste citoplasmático (Amarillo de Mars) - contraste nuclear (hematoxilina de Harris)

COMPUESTOS CON PAS (-), SIN EMBARGO SON HIDRATOS DE CARBONO

Resultado fuertemente positivo: - azul de toluidina. - pricrocarmín de índigo. - verde de metileno.

Mucopolisacáridos ácidos. IMPORTANTE: si tienen grupos sulfatos no se tiñe con pas.

Control con la técnica del PAS-Diastasa

• Como la diastasa destruye el glucógeno,con este control es lo que conseguimos
• Se usa para poner en manifiesto estructuras PAS+ como mucinas o glucolípidos

Controles de la técnica deL PAS

• Se realizan 2 cortes:

• El primer corte: PAS normal + tinción de todas las estructuras PAS+ incluido el glucógeno

• El segundo corte: Degradación del glucógeno con diastasa + realizar PAS normal

(se tiñen estructuras como mucina o lípidos) (NO SE TIÑE GLUCÓGENO)

Técnica de la plata metenamina

Funciona muy parecido al PASHay que oxidarla con acido peryódico ó acido crómico El pH es alrededor de 9 para que funcione Cuando es plata metanamina + también es PAS+ Si sale + son membranas basales Todos los resultados + salen en negro

Reacciones generales para determinar mucopolisacáridos ÁCIDOS

Reacción metacromática

Técnica de azul alcián

Podemos definir reacción metacromática como; cuando un colorante químicamente puro tiñe selectivamente una estructura tisular de color diferente al de la solución diluida de colorante Los colorantes metacromáticos diluidos en alcohol se comportan como ortocromáticos (diluidos en agua a altas temperaturas) Los colorantes metacromáticos diluidos en agua se comportan como metacromáticos (concentrados a bajas temperaturas) Peculiaridades del fenómeno de la metacromasia: Cuando en el tejido hay cargas negativas muy cerca y se apilan los dobles enlaces del colorante, se produce un fenómeno de polarizacion formandose dipolos (unas cargas a un lado y otras a otro) en el lado de la carga negativa se apila el colorante y la absorbancia varia dando un color distinto en el espectro de visión

Fijación mediante formalina tamponada al 10%Azul alcián a pH 2,5: Tiñe todos los mucopolisacáridos ácidos Azul alcián a pH 1: Tiñe todos los sulfumucopolisacáridos ácidos Azul alcián a pH 0,5: Solo tiñe los sulfumucopolisacáridos ácidos conjuntivos El uso del rojo nuclear junto con el azul alcián es habitual para realizar contrastes

Generalidades sobre técnicas Histoquímicas de metacromasia

Importante factor de influencia, siendo los cortes de tejido congelado o fijado por liofilización los que menos problemas dan.En el caso de los mucopolisacáridos se pueden emplear tejidos fijados en bouin alcohol por ejemplo, evitándose así los fijados en agentes oxidantes

1. Fijación

Los más utilizados son el Azur A y el azul de Toluidina. Es preferible usar soluciones aún mas diluidas para colorear estructuras fuertemente metacromáticas

2.COLORANTES

3. Disolventes y ph de la disolución

Como disolvente se suele utilizar agua destilada o alcohol etílico al 30%El pH puede variar por lo que tiene gran interes para la caracterización de MPSA

4.Montaje de las preparaciones

Es imprescindible contrastar la observación de cortes montados convencionalmente y montados en medio acuoso

TÉCNICA PARA DIFERENCIAR MUCOPOLISACÁRIDOS NEUTROS, CARBOXIMUCOPOLISACÁRIDOS, SULFOMUCOPOLISACÁRIDOS Y GLUCOPROTEÍNAS

ASOCIACIÓN ENTRE TÉCNICAS PARA LA DEMOSTRACIÓN DEL MPSA Y MPS NEUTROS Y GLUCOPROTEÍNAS; TÉCNICA DEL AZUL DE ALCIÁN-PAS

Diferenciación entre hidratos de carbono gracias a la técnica más compleja del azul-amarillo alcián25

HISTOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS

APLICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DIGESTIÓN ENZIMÁTICA AL ESTUDIO HISTOQUÍMICO DE LAS PROTEÍNAS

FIJACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Radical proteína

Radical reactivo

• Se usa en histoquímica e inmunohistoquímica.
• Fijación: formol (4%) como metedo de elección.

PRINCIPALES PROTEASAS:

FIJADOR: - Formol =formalina (4%)

PEPSINA:

• estómago
• PH; entre 1,5 y 2

TRIPSINA:

• páncreas
• PH; entre 7 y 8

PRONASA:

• bacteria
• (+ usada)

No es aconsajable fijar con:

• ALCOHOL ETÍLICO
• FIJADORES CON METALES PESADOS

En Inmunohistoquímica: ANTÍGENOS

- Se usan las proteasas para digerir proteínas y estám en el PH natural de la proteína se puede observar los grupos funcionales.

FIJADOR: -Congelación

MÉTODO HISTOQUÍMICO PARA LA COLORACIÓN DE PROTEÍNAS

- BUSCAR GRUPOS CARBONILO

REACCIONES ESPECÍFICAS: -Investigar su composición. -Varias de estas reacciones de han dejado de usar.

REACCIONES GENERALES: - saber la cantidad de proteínas (mucha o poca). - Reacción de Biuret.

REACCIONES EN GRUPOS: Fucsina ácida + Ácido sulfuroso

• Tetrazorreacción
• Nihidrina de schiff

REACTIVO DE SCHIFF (incoloro):

• PAS: Ácido peryódico
• NIHIDRINA: nihidrina + reactivo de schiff
• FEULGEN: HCL

- Solo se une si está a una determinada distancia de los grupos carbonilo; sino no. (entre 1 y 1,1 nm).

HISTOQUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

REACCIÓN DE FEULGEN

CONTROLES DE LA TÉCNICA DE FEUGLEN: - Si no echas HCL (feuglen) y Ácido peryódico (PAS), en el recativo de shciff, se colorea, si no se colorea da un FALSO +.

SI ADN NO ARN

Tambiénn llamado "ácido sulfofucsídico"

1. HIDRÓLISIS ÁCIDA DEL ADN: Con HCL demuestra los grupos carbonilo con el reactivo de schiff. Si están a la distancia adecuada hay una nueva molécula con el color de ADN.

IMPORTANCIA DE LA TÉCNICA DE FEUGLEN: - Radica en que podemos saber en la cantidad de ADN que tiene. - El ADN se pide por pares de bases. - Contraste con verde luz. - Si hay mucha mitosis ( lesiones pre o cancerosas). - Desventajas : pasarnos con la hidrolis o pasar el reactivo de schiff),

2. DEMOSTRACIÓN DE LOS GRUPOS CARBONILO: El ARN no puede ser detectado por el reactivo de schiff, por lo que no están situados a la distancia de 1 o 1,1 nm.

PROBLEMAS GENERALES DE LA REACCIÓN DE FEUGLEN: 1. HIDRÓLISIS EXCESIVA: - Echar HCL y quedarse mucho tiempo. - según fiador, se tardará más o menos. - salen menos negativos.

2. ENVEJECIMIENTO DEL REACTIVO DE SHCIFF: - Es incoloro. - Aparición de una tonalidad rosada por la libetación de fucsina indica evejeciemineto. - Inservible para detectar grupos carbonilos

TÉCNICA PARA LA DISTINCIÓN DE ADN Y ARN

MÉTODO DEL VERDE METILO-PIRONINA

PROBLEMAS DE LA PREPARACIÓN Y EL MANEJO DE LOS REACTIVOS: - Para que ocurra una coloración diferencial es fundamental que se realice con un PH constante entorno a 5. - El alcohol etílico tiene la propiedad de disolver la pironina.

- Distinguir las células dotadas de gran capacidad secretora de proteínas y, por tanto, ricas en ARN ribosómico como las células plasmáticas productoras de inmunoglobulinas.

FUNDAMENTO: la basofilia de los ácidos nucleicos está ligada a la presencia de grupos ácidos ionizables pertenecientes el ácido fosfórico. Con PH adecuado, dichos grupos tienen la propiedad de fijar los grupos electro+ de ciertos colorantes básicos:

OBSERVACIONES: - En la deshidratanción de los alcoholes hay que controlar el tiempo porque sino se pierde el colorante. - Se duplica la cantidad de pironina para compensar la pérdida de color.

• Verde metilo.
• Pironina.

ARN : ROJO (PIRONINA Y,G). ADN: VERDE (VERDE DE METILO).

- La pirorina Y o G es un colorante derivado del xanteno, que tiene apetencia por el ARN (especificidad no absoluta).

MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE AMINAS BIOGENAS

REACCIÓN CROMAFÍN

Se encuntran en la glándula suparrenal:

ADRENALINA O NORADRENALINA

+ DICROMATO POTÁSICO

• ADRENALINA
• NORADRENALINA
• SEROTONINA

SON HORMONAS

- Usar fijador el dicromato potásico para poder detectarlas (reacción cromafín).

SEROTONINA:

ÓXIDO DE CROMO + KOH

• detectarse histoquímicamnete a través de la reacción cromafín.
• Se porduce por:

- Plaquetas (vasoconstrictor). - Pared de revestimiento del digestivo (inhibe la sección gástrica) - Éncefalo (neutransmisor y control de la conciencia)

PIGMENTO PARDO

ADRENALINA:

CONTRASTE: - Hematoxilina.

• Taquicardia
• Aumento del latido cardiaco
• vasoconstricción en piel e intestino
• Favorece la respiración

NORADRENALINA:

• Vasoconstricción presión sanguínea cae por debajo de lo svalores normales.