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Tema 8. Tecnicas de extracción y purificación de proteínas/enzimas
caljor18
Created on January 12, 2022
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Transcript
tema 8. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEINAS Y ENZIMAS.
índice
Tema 3. Parte I
4. Concepto de técnica de purificación por tecnicas cromatográficas.
1. Concepto de tecnica de extracción y purificación.
5.Descripción de las técnicas de control de la purificación: Electroforesis SDS
2. Descripción del proceso de extracción de proteinas y enzimas.
6. Desarrollo practico de un proceso de purificación de una mezcla de 3 proteinas
3. Descripción del proceso de precipitación selectiva y desalado.
SECCIÓN 1. Concepto de tecnica de extracción y purificación.
CONCEPTO
CONCEPTO GENERAL DE PURIFICACIÓN El conocimiento sobre la estructura y función de las proteínas procede del estudio de muchas proteínas individuales. Para estudiar una proteína en detalle es necesario separarla y disponer de técnicas que permitan determinar sus propiedades
CONCEPTO
TÉCNICA DE EXTRACCIÓN. Mediante el procedimiento de extracción conseguimos separar la proteinas/enzima de su medio natural intra o extracelular. Estas técnicas aplican métodos mecanicos y no mecanicos para extraer el contenido de interés.
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN
PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN: 1) Extracción del tejido de interes. 2) Lisis celular. 3) Homogeneización. Mecanica y no mecanica. 4) Centrifugación. Simple, Diferencial y Zonal.
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN
PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN: 1) Extracción del tejido de interes. Uso de tecnicas diversas que incluyen el cuchillo, tijeras y pinzas. 2) Lisis celular. Empleando procedimientos mecanicos suaves conocidos como la Homogeneizacion, que permite la ritura de las membrans¡as celulares.
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN
PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN: 3) Homogeneización. Mecanica y no mecanica. Mecanica: Emplea medios mecanicos para la obtencion de una suspensión de fragmentos celulares. No Mecanica: Emplea reactivos y procesos no mecanicos para el mismo fin anterior. 4) Centrifugación. Simple, Diferencial y Zonal.
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN
PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN: 4) Centrifugación. Simple, Diferencial y Zonal. Consiste en separar solidos de distinta densidad mediante un movimiento que afecta a la mezcla con una fuerza centrifuga mayor que la de la gravedad.
SECCIÓN 2.Descripción del proceso de extracción de proteínas y enzimas.
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN MECÁNICA
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN NO MECÁNICA
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN NO MECÁNICA
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN NO MECÁNICA
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN NO MECÁNICA
LISIS ESPIRULINALIBERACIÓN DE FICOCIANINA
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN : OTROS
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
HOMOGENEIZACIÓN : OTROS
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS/ENZIMAS.
CENTRIFUGACIÓN
SECCIÓN 3.Descripción del proceso de precipitación selectiva y desalado.
pROCESO PRECIPITACIÓN SELECTIVA:
Consiste en la separación de las proteínas en función de su distinta solubilidad cuando se añade una sal, sulfato amónico, consiguiéndose una precipitación fraccionada.
PROCESO DESALADO:
Consiste en separar la sal que empleamos en la precipitación fraccionada de las proteínas, mediante diálisis o cromatografía de exclusion por tamaños.
pROCESO PRECIPITACIÓN SELECTIVA:
El efecto global de la adición de una gran cantidad de sal muy soluble es que comienzan a precipitar las proteínas, pero unas antes que otras, lo que se puede aprovechar para hacer una primera purificación grosera.
pROCESO PRECIPITACIÓN SELECTIVA:
pROCESO PRECIPITACIÓN SELECTIVA:
pROCESO PRECIPITACIÓN SELECTIVA:
PROCESO DESALADO:
Consiste en separar la sal que empleamos en la precipitación fraccionada de las proteínas, mediante diálisis o cromatografía de exclusion por tamaños.
PROCESO DESALADO:
PROCESO DESALADO- dialisis.
PROCESO DESALADO- dialisis.
PROCESO DESALADO- filtración en gel
PROCESO DESALADO- filtración en gel
SECCIÓN 4.Concepto de técnica de purificación por técnicas cromatográficas.
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
Se trata de un método de purificación mas potente, que fracciona las proteínas en base a su capacidad de retención sobre una fase estacionaria especifica, y posterior elución en extractos determinados. Este método se denomina Cromatografía.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA. Las más empleadas son las cromatografía de exclusión por tamaño o filtración en gel, intercambio iónico y afinidad.
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
técnicas de purificación de proteínas/enzimas
SECCIÓN 5.Descripción de las técnicas de control de la purificación: Electroforesis SDS.
electroforesis. fundamento.
La electroforesis de proteínas y/o enzimas se lleva acabo en geles formados por un polímero entrecruzado de poliacrilamida, actúa como un tamiz molecular, retrasando la migración de la proteína en una forma aproximadamente proporcional a su cociente carga/masa. La fuerza que mueve es el potencial eléctrico, E, y el desplazamiento es función del tamaño de la proteína y/o enzima
electroforesis. PROCEDIMIENTO.
DESARROLLO
Se cargan diferentes muestras en los pocillos o depresiones en la parte superior de un gel de poliacrilamida. Las proteínas se trasladan a través del gel cuando se aplica un campo eléctrico. El gel mantiene al mínimo las corrientes de convección producidas por pequeños gradientes de temperatura, y también minimiza los movimientos de proteínas que no sean los producidos por el campo eléctrico.
electroforesis. PROCEDIMIENTO.
DESARROLLO
Después de la electroforesis se pueden visualizar las proteínas tratando el gel con un colorante tal como el azul de Coomassie, que se fija a las proteínas pero no al gel. Cada banda del gel representa una proteína diferente, las proteínas mas pequeñas se desplazan mas rápidamente a través del gel que las grandes, por lo que se encuentran cerca del extremo inferior del gel
electroforesis. PROCEDIMIENTO.
electroforesis. PROCEDIMIENTO.
DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE ELECTROFORESIS DE PROTEINAS/ENZIMAS
VIDEO:
SECCIÓN 6.APLICACIÓN DEL DESARROLLO DE LA PURIFICACIÓN Y CONTROL.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
APLICACIÓN PRÁCTICA 1. PURIFICACIÓN DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS.
SECCIÓN 6. DESCRIPCIÓN AVANZADA DEL PROTEIN LAB.
¡GRACIAS!