UD 6 Introducción a los AANN y técnicas de PCR

TÉCNICAS DE PCR

- Los AANN: Nucleótidos, ADN y ARN. - Dogma Central de la Biología Molecular.- Las técnicas de PCR, Variantes y aplicaciones .- Materiales y Reactivos para la amplificación. - Preparación de la mezcla de reacción. - Programacióndel termociclador. - Determinación del tramaño de los fragmentos amplificados.

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Índice

1. AANN

2. DOGMA CENTRAL

4. Bases teóricas

3. PCR

6. Tipos de PCR estandar o convencional

5. PCR estandar o convencional

8. PCR a tiempo real

7. Otras PCR

INTRODUCCIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS

Nucleótidos

INTRODUCCIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS

Nucleótidos

Bases Nitrogenadas

Pentosas en los nucleótidos

Ácido fosfórico e ión fosfato

Formación de un nucleósido: Ribosa + Base PÚRICA (ribonucleósido)

liberación de una molécula de agua

Entre el C1 de la pentosa y el N9 de la base púrica

"En las células los nucleósidos en forma libre se encuentran en cantidades muy poco significativas y en todo caso como productos de transición en la síntesis y degradación de ácidos nucleicos"

Formación de un Nucleótido: Nucleósido + Ácido fosfórico

Enlace fosfoéster

Formación de un nucleótido (trímero)

Enlace fosfodiéster

Formación de un oligonucleótido

Extremos 5' y 3' terminales

Durante la polimerización, los nucleótidos siempre se incorporan al OH del carbono 3'

Otros nucleótidos de interés biológico con función:

• Estructural, como monómeros de los ácidos nucleicos
• Energética, como monedas transportadoras de energía
• Coenzimática, como coenzimas (o co-autores orgánicos) de enzimas.

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN

Estructura primaria del ADN

• Secuencia de una hebra.
• Unidos por enlaces fosfodiéster.
• Extremos 5’ y 3’ terminales.
• Numerosas combinaciones (ADN humano 3.200 millones de pares de bases: 4 3200x106)

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN

Estructura primaria del ADN

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN

Estructura secundaria del ADN

• La densidad del ADN era mayor a la esperada según su composición: puentes de hidrógeno.
• Chargaff:

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN

Estructura secundaria del ADN

• Rosalind Franklin:

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN

Modelo de Watson y Crick

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN

Modelo de la doble hélice

• Dos hebras antiparalelas.
• Dos hebras complementarias:
• La estabilidad de la cadena se debe a los puentes de hidrógeno entre A y T (2) y C y G (3).
• El número de puentes se debe a los grupos polares de las bases.

Esquema de la doble hélice (estructura secundaria)

La longitud de una molécula de ADN se expresa habitualmente en pares de bases (pb): 1 pb = 1 par de bases. 1 kpb o kb (kilobase) equivale a 1000 pb 1Mpb o Mb (megabase) = 106 pb 1 Gpb o Gb (Gigabase) = 109 pb

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN

Modelo de la doble hélice

• Dos hebras enrolladas de forma dextrógira.
• Enrollamiento plectonémico: para separar las dos hebras hay que desenrollar una respecto a la otra.
• La relación espacial en la doble cadena da lugar a un surco mayor y a un surco menor en la doble hélice.

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN

Modelo de la doble hélice

• Cada vuelta de la doble hélice está formada por diez pares de nucleótidos, por lo que la longitud de la vuelta es de 3,4 nm y cada pareja de nucleótidos está a una distancia de 0,34 nm de la siguiente.

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Ver tema Hibridación de AANN

Desnaturalización del ADN

• A altas temperaturas (aprox. 100ºC) los puentes de hidrógeno se rompen y las dos hebras se separan (desnaturalización). Si se baja la temperatura lentamente de nuevo pueden volver a unirse (renaturalización).
• Cambios en el pH también provocan desnaturalización (reversible también).

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Empaquetamiento en las celulas procariotas

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Empaquetamiento en las celulas procariotas (nucleoide bacteriano de bacilos y cocos al microscopio electrónico)

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Fibra de cromatina de 10 nm o el “collar de perlas”

Fibra de cromatina laxa

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Fibra de cromatina de 10 nm o el “collar de perlas”

Fibra de cromatina de 10 nm

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Fibra de cromatina de 10 nm o el “collar de perlas”

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Nucleasoma

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Fibra de cromatina de 30 nm o solenoide

Eje central del solenoide

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Fibra de cromatina de 30 nm o solenoide

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Dominios en bucle

Eje central del solenoide

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN: Niveles de condensación

Rosetones y espirales de rosetones

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN en distintos seres vivos

ADN en células eucariotas

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

1. El ADN en distintos seres vivos

Nucleoide bacteriano

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

Tipos de ácidos nucleicos en virus

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

2. El ARN

• En células procariotas y eucariotas y en virus.
• Más abundante que el ADN en las células.
• Algunos ARN tienen función biocatalizadora (ribozimas).

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

2. El ARN monocatenario y bicatenario

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

2. El ARN transferente (ARNt)

Estructura del ARNt

Zonas de doble hélice

Zonas en asa o bucle

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

Estructura del ARNt

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

Expresión genética

2. El ARN mensajero (ARNm)

Este proceso es parte del Dogma Central de la Biología Molecular que veremos más adelante.

Vamos a centrarnos por el momento en la función estructural

2. El ARN

Maduración del ARNm: el transcrito primario o pre-ARNm

Capucha (CAP)

Capucha: protección contra exonucleasas y señal de inicio para la traducción

Cola de poli A

poli A: retrasa la llegada de las exonucleasas

Segmento 3’ UTR (UnTranslated Region)

Segmento 5’ UTR (UnTranslated Region)

Segmento UTR: segmento que no se traduce pero interviene en la expresión del ARNm

ARNm procariótico

ARN monocistrónico y ARN policistrónico

ARN ribosómico (ARNr)

Composición de los ribosomas

ARN ribosómico (ARNr)

Coeficiente de sedimentación (unidad: S)

ARN nucleolar (ARNn)

El ARN lleva la información genética del ADN a los ribosomas

ADN

ARNm

Transcripción de ADN a ARNm

Maduración del ARNm

Pequeñas moléculas de ARN se encargan de eliminar los intrones del transcrito primario de ARN

Maduración del ARNm

Maduración del ARNm

Recopilando...

Hemos visto los tipos de AANN y sus características

Ahora vamos a ver cómo fluye la información genética de una generación a otra: El DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

Genética molecular o la química de la herencia.

2. DOGMA CENTRAL DE LA BM

Una vez estudiados los AANN vamos a ver cómo se transmite o cómo fluye la información genética de una generación a otra.

"Para comprender el funcionamiento de las enzimas implicadas en las técnicas de PCR necesitamos comprender cómo funcionan en los organimos biológicos"

Recopilando...

Después de ver cómo es la estructura de la molecula de la vida

• ¿Cómo se almacena la información genética?
• ¿Cuál es el fin del alamacenamiento?
• Para que el ADN cumpla su función biológica depende de procesos metabólicos, ¿cuales son?

¿Cómo fluye la información genética de una generación a otra?

¿Cómo fluye la información genética de una generación a otra?

(las flechas de color morado solamente la realizan algunos tipos de virus de ARN)

REPLICACION

Experimentos previos

Experimento de Griffith (1928)

REPLICACION

Experimentos previos

Experimento de Griffith (1928)

REPLICACION

Experimentos previos

Experimento de Avery (1944)

REPLICACIÓN

Es el proceso por el cual una molécula de ADN se duplica para dar lugar a dos moléculas de ADN hijas identicas, que conservan la misma secuencia de bases qie la molécula inicial

Características generales de la replicación en procariotas y eucariotas

• Es semiconservativa. En cada molecula hija una de las cadenas procede de la molecula original que se replica y la otra cadena es de nueva síntesis.
• Comienza en un origen de replicación. Son puntos de iniciación concretos. En procarioras hay un unico origen de replicación mientras que eucariotas hay muchos.
• Es bidireccional y secuencial. Se produce nucleotido a nucleotido en ambas direcciones por lo que se forman horquillas de replicación.
• Es semidiscontinua. La sintesis de las cadenas nuevas siempre se prodice en dirección 5' - 3' y la lectura de la cadena molde de 3' - 5'. Esto da lugar a los fragmentos de Okazaki, donde hay una hebra adelantada o conductora que sintetiza de manera contunua y otra hebra retardada que se sintetiza a fragmentos.

REPLICACIÓN

ENZIMAS DEL PROCESO DE REPLICACIÓN

ENZIMAS DEL PROCESO DE REPLICACIÓN

Proteina de unión a cadena sencilla (SSBP)

Helicasa

ADN polimerasa

Girasa y topoisomerasa

Ligasa

Primasa

FASES REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

La replicación en eucariotas a grandes rasgos es similar a la de procariotas con algunas peculiaridades:

• Múltiples orígenes de replicación en varios puntos de cada cromosoma.
• Hay 5 tipos de polimerasas que se reparten las tareas de elongación, eliminación de cebadores y corrección de errores.
• El ADN eucariótico se encuenta unido a histonas por lo que durante la replicación se van estructurando también los nucleosomas.

TRANSCRIPCION

Es el proceso por el cual se sintetiza ARN a partir de una cadena de ADN como molde.

REQUISITOS

• ADN que actúe como molde.

TRANSCRIPCION

Es el proceso por el cual se sintetiza ARN a partir de una cadena de ADN como molde.

REQUISITOS

• Enzimas: ✴una ARN pol en procariotas y ✴tres ARN pol diferentes en eucariotas. • Ribonucleótidos trifosfato de A, C, G y U.

TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS: Iniciación

TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS: Elongación

TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS: Terminador

"No hay maduración del ARNm en procariotas"

TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS

Promotor de la transcripción

TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS

Promotor de la transcripción

TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS: Elongación

“capping”

TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS: Terminación

“capping”

TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS: Maduración

corte y empalme (splicing)

Diferencias entre la transcripción en organismos procariotas y eucariotas

Genético

Nueva York, 17/10/1959. El Doctor Severo Ochoa, al centro, felicitado por sus colaboradores y colegas de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nueva York, al conocerse la noticia de la concesión del Premio Nobel de Medicina

¿Cómo se pasaba de un lenguaje de cuatro letras a otro lenguaje formado por 20 elementos distintos?

Se necesitaba un diccionario

Ese diccionario es el Código Genético

Genético

Si solo fuese 1 base 41 = 4 aaINSUFICIENTE

pero son 20 aminoácidos distintos no solo 4

Genético

Si solo fuesen 2 bases 42 = 16 aaINSUFICIENTE

pero son 20 aminoácidos distintos no solo 16

Genético

Si solo fuesen 3 bases 43 = 64 aaSUFICIENTE

pero son 20 aminoácidos distintos no solo 16

Genético

Es la relación de correspondencia entre las bases nitrogenadas del ARNm y los aminoácidos para los que codifica.

Genético

Es la relación de correspondencia entre las bases nitrogenadas del ARNm y los aminoácidos para los que codifica.

Genético

El código genético establece una correspondencia entre las bases nitrogenadaas del ARN y los aminoácidos que codifica

Genético

Características

Es universal con mínimas excepciones, es decir, un codón específico codifica el mismo aa en un procariota, eucariota y virus. Está degenerado: Hay 20 aa y 61 codones codificantes (tres de STOP) por lo que el código genético es redundante, es decir, un aminoácido puede estar codificado por más de un codón. Los diferentes codones que codifican el mismo aa se llaman sinónimos. Sin imperfección ni ambiguedad: un codón solo codifica para un aminoácido. Es continuo y no solapado: en la cadena de ARNm, los codones se disponen de manera secuencial uno a continuación delotro, sin espacios ni comas y sin compartir ninguna base.

Genético

TRADUCCION

La traducción consiste en transformar la información contenida en la secuencia de bases del ARNm en una secuencia de aminoácidos de una proteína.

TRADUCCION

Componentes necesarios

✤ Nucleótidos trifosfato (energía)

✦ ARNt

✦ ARNm

✤ Aminoácidos

✤ Enzimas

✦ Ribosomas (con ARNr)

1. PCR

Reacción en cadena de la polimerasa

Kary Mullis

Químico estadounidense (1944-2019)

1993 compartió el Premio Nobel de Química con Michael Smith, debido a la invención de la reacción en cadena de la polimerasa

+ Info

2. Bases teóricas

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3. PCR estandar o convencional

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4. Tipos de PCR estandar o convencional

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5. Otras PCR

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6. PCR a tiempo real

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gracias