Tema 3. Técnicas de siembra y recuento

tema 3. TéCNICAS DE SIEMBRA Y RECUENTO MICROBIANO.

índice

Tema 3

4. Concepto de Recuento de microorganismos: Diluciones seriadas

1. Concepto de Siembra e Inoculación.

5. Técnica de recuento por el NMP y Filtracion por membrana.

2. Etapas de la obtención de un cultivo: Elección tecnica y material

3. Técnica de siembra en Placa, Tubo y Medios Líqudios.

6. Tecnica de recuento en superficie y profundidad. Calculos.

SECCIÓN 1. Concepto de Siembra e Inoculación..

CONCEPTO

IINOCULACION: Es el acto de agregar o depositar una cantidad de material (llamado inóculo) que presuntamente contiene microorganismos a un medio de cultivo. SIEMBRA: Es la suma de la inoculación más el reparto del inóculo; cuando no hacemos reparto del inóculo, la siembra se reduce sólo a la inoculación.

SECCIÓN 2.Etapas de la obtención de un cultivo: Elección tecnica y material.

FASES QUE CONSTA LA OBTENCIÓN DE UN CULTIVO

- Tomar la muestra representativa del total. - Transpornte, conservación y preparacion de la muestra. - Realizar la técnica de siembra correspondiente. - Realizar la técnica de incubación a temperatura y tiempo necesarios.

elección de la técnica y material empleado.

ELECCIÓN DE LA TÉCNICA.

La elección de una técnica de siembra, ante las varias existentes, depende de los objetivos que se quieren alcanzar y también de las características de la muestra.

ELECCIÓN DEL MATERIAL.

SECCIÓN 3.Técnica de siembra en Placa, tubo y medios liquidos.

tipos de cultivo y la siembra

Vamos a estudiar las distintas técnicas de siembra en medios sólidos suponiendo que la muestra ya se ha preparado adecuadamente, lo que suele incluir su homogeneización o emulsión y otras veces su dilución.

metodos de siembra en placa.

Estos métodos se aplican sobre medios con agar contenidos en placas Petri. Su utilidad es: Aislamiento con o sin identificación; Recuento de germenes; Antibiogramas

MÉTODO DE AGOTAMIENTO DEL ASA

FUNDAMENTO: consiste en inocular una placa y, a continuación, tocar el inóculo con el asa haciendo estrías sobre la superficie de la placa. UTILIDAD: Aislamiento de microorganismos en colonias diferenciadas

FORMAS DE INOCULAR.

* Una placa puede inocularse directamente con el asa. * Los inoculos liquidos pueden aplicarse con una micropipeta. * Inoculos mediante un escobillon.

MÉTODO DE AGOTAMIENTO DEL ASA

PROCEDIMIENTO: La extensión del inóculo se hace tocando la superficie del agar donde se ha depositado y, a partir de aquí, realizando estrías sobre el agar.

precauciones.

* la presión del Asa de siembra sobre el agar no debe ser excesiva. * La mayoria de las estrias no deben tocarse unas con otras. * Para aprovechar bien la placa hay que conseguir la mayor longitud posible de recorrido total del asa.

TÉCNICAS DE AGOTAMIENTO DEL ASA.

TÉCNICAS DE AGOTAMIENTO DEL ASA.

TÉCNICAS DE AGOTAMIENTO DEL ASA.

MÉTODO DE SIEMBRA EN SABANA-SUPERFICIE

FUNDAMENTO: El método en esencia consiste en cubrir toda la superficie del ágar con el inóculo de modo que esté repartido de la forma más homogénea posible. UTILIDAD: Realización de antibiogramas y recuento semicuantitativo de gérmenes totales.

tipos.

* Técnica de siembra en sábana con escobillón (hisopo). * Técnica de siembra en sábana con asa en L (asa Digralsky.

MÉTODO DE SIEMBRA EN SABANA-SUPERFICIE

MÉTODO DE SIEMBRA EN SABANA-SUPERFICIE

MÉTODO DE SIEMBRA EN SABANA-PROFUNDIDAD

FUNDAMENTO: El método en esencia consiste en la inoculación del cultivo previa al vertido en placa del medio de cultivo. UTILIDAD: Selección de microorganismos con características especiales anaerobicas.

MÉTODO DE SIEMBRA EN SABANA-PROFUNDIDAD

MÉTODO DE SIEMBRA EN SABANA-PROFUNDIDAD

tÉCNICAS DE SIEMBRA EN TUBO

FUNDAMENTO: Consiste en el uso de medios solidos solidificados en tubos en diferentes formas. El objetivo fundamental es la conservación de los cultivos.

tipos de preparación.

tÉCNICAS DE SIEMBRA EN TUBO

tÉCNICAS DE SIEMBRA En medios líquidos

FUNDAMENTO: Consiste en la preparacion de una serie de diluciones de una muestra original que presenta mucha biomasa y queremos graduar esa concentración.

SECCIÓN 4.Concepto de Recuento de microorganismos: Diluciones seriadas.

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLACA

FUNDAMENTO: Consiste en determinar el tamaño de la población bacteriana o, en general, microbiana, de una muestra.

FACTORES A CONSIDERAR: Hay técnicas que realizan recuentos totales de gérmenes, mientras que otras sólo cuentan los gérmenes viables (con capacidad de reproducirse). Todas las técnicas de recuento tienen una imprecisión muy elevada

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLACA

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA El procedimiento habitual es realizar una serie de diluciones decimales seriadas y utilizar las diluciones que se consideren convenientes para el recuento. PROCEDIMIENTO: Los procedimientos de recuento de germenes totales utilizan metodos físicos (microscopia), mientras que los recuentos de germenes viables utilizan cultivos. Son las mas usadas en el recuento de bacterias, levaduras y esporas de hongos.

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLACA

ASPECTO DE LAS COLONIAS. FORMAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO. En la superficie de un medio de cultivo solido podemos distinguir basicamente 3 formas de crecimiento: 1. Crecimiento en colonias: Forma normal de crecimiento de bacterias y levaduras. 2. Crecimiento en oledadas: Es característico de algunas especies bacterianas especialmente de las del genero Proteus. 3. Crecimiento en colonias de hongos miceliformes: Tiene varias peculiaridades que las diferencian de las colonias bacterianas.

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLACA

ASPECTO DE LAS COLONIAS. DESCRIPCIÓN DEL ASPECTO. Cuando nos enfrentamos a la caracterización de una bacteria por el aspecto de sus colonias hay que proceder a describir estas colonias, De una colonia se puede describir: FORMA DE SU PERFIL: Elevación FORMA DE SU PLANTA O CONTORNO: Borde. SUPERFICIE: lisa o rugosa. CONSISTENCIA: Cremosa, mucosa, seca o dura. TAMAÑO: Grande, mediana o pequeña. CARACTERISTICAS OPTICAS: Color, paso de luz: transparente, opaca o translucida.

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLAca. profundidad

IMPORTANCIA Y USOS: Esta es, con diferencia, la tecnica de recuento en medio solido mas utilizada en microbiologia alimentaria. Deben contarse solo placas con un numero de colonias entre 30 y 300. Utilizamos duplicados para dilucion seriada, pero en algunos casos se emplean hasta 3 placas por dilución. MODALIDADES: - Técnica de inoculación previa al vertido en placa. - Técnica de siembra en masa con inoculacion en placa.

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLAca. profundidad

PROCEDIMIENTO VISUAL:

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLAca. profundidad

VIDEO 1

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLAca. SUPERFICIE

FUNDAMENTO: En esta variante de la tecnica de recuento en masa, inoculando en la superficie 0,1 mL y extendiendola con el asa de driglasky, se debe considerar el factor de dilución y la cantidad depositada. PASOS A SEGUIR: - Se deposita un pequeño volumen del inóculo sobre la parte central del medio de cultivo contenido en una placa Petri. - Se extiende el inóculo con el asa Digralsky por toda la superficie del medio aplicando un movimiento de rotación. Se deja secar la placa antes de proceder a su incubación.

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLAca. SUPERFICIE

PROCEDIMIENTO VISUAL:

tÉCNICAS DE RECUENTO EN PLAca. SUPERFICIE.

VIDEO 2

SECCIÓN 5.técnica de recuento por el NMP y FiltraciÓn por membrana.

TÉCNICA DE RECUENTO POR EL NMP

FUNDAMENTO

Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de m.o. (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en un medio líquido)

TÉCNICA DE RECUENTO POR EL NMP

REQUISITOS:

Se requiere la realización de una serie de diluciones decimales seriadas de la muestra. Se inocula 1 ml de cada dilución en un nº de tubos (3, 5 etc., según sea la tabla del NMP) que contienen 10 ml de un medio líquido adecuado, En serie como si fuesen las diluciones seriadas 10^-1, 10^-2 y 10^-3.

TÉCNICA DE RECUENTO POR EL NMP

CRITERIO:

Según el tipo de m.o que se desea contar se utilizan distintos medios en muchos casos selectivos. En función de esto se puede considerar como positivos aquellos tubos en los que: -Hubo crecimiento que se detecta como aparición de turbidez. -Detección de productos del metabolismo del m.o.:Producción de gas, viraje de un indicador de pH y producción de un pigmento.

TÉCNICA DE RECUENTO POR EL NMP

INTERPRETACIÓN:

CONSULTA TABLA NUMERO MAS PROBABLE. 0,1, 1 Y 10 mL sembrados de muestra en 10 mL de medio correspondiente. Ejemplo: 3-2-1 tabla NMP: 150

TÉCNICA DE RECUENTO POR EL NMP

VIDEO 3:

SECCIÓN 6.tÉcnica de recuento en superficie y profundidad. cálculos y ejemplos prácticos.

SECCIÓN 6. técnicas de recuento en masa: Profundidad.

Los cálculos para obtener el valor del número de células/mL es:nº células recuento= (1/dilución)*(1/volumen inoculado)

SECCIÓN 6. técnicas de recuento en masa: superficie.

Los cálculos para obtener el valor del número de células/mL es:nº células recuento= (1/dilución)*(1/volumen inoculado)

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