realtime pcr

REALTIME PCR

Quantitive PCR

PCR כמותי qPCR

נושאים חשובים

סוגי גלאים פלורוסנטים

קריאה וניתוח התוצאות

עקרונות השיטה

שלבים בתהליך

חומרים בתהליך

ערך סף

נרמול תוצאות

ערך CT

SYBR Green

הבדלים בין PCR, RT-PCR ו Realtime PCR

TaqMan

גן מנרמל

הבדלים בין השיטות

כמות חומר שווה

מאפיינים של האנזים RT

מהו realtime PCR?

שלבי התהליך

מטרה

שיטת ה-Real-time PCR או qPCR הינה שיטה המשמשת לקביעת כמות יחסית של מולקולות mRNA שתועתקו ממספר גנים. ניתן להשוות את רמת הביטוי של מולקולות mRNA באותה רקמה, תא, או לצורך השוואה ברמת הביטוי של גנים מסוימים בין רקמות שונות. מכשיר ה Realtime PCR מודד את רמת הפלורוסנציה לאחר כל מחזור שכפול. היתרון העיקרי הוא שאין צורך להריץ ג'ל בסיום התהליך

1. הפקה של mRNA ובנייה של cDNA על ידי האנזים RT. 2. PCR בנוכחות גלאי פלורוסנטי

בדיקת שינוי בביטוי גנים ברקמה בעקבות התמרה סרטנית

אבחון הדבקה בפתוגנים שונים

שימושי realtime PCR

Any question?

בדיקת תגובת התא לטיפול מסויים

החומרים בתהליך

בשלב הראשון

בשלב השני

Lorem ipsum dolor sit amet

האנזים reverse transcriptase

מקור האנזים המתעתק במהופך (RT) הוא בוירוסי RNA האנזים בונה cDNA לפי תבנית של RNA יש צורך בתחל שאותו האנזים מאריך האנזים מאריך גדיל DNA על ידי הוספת נוקלאוטידים dNTP מתקבל עותק משלים של DNA חד גדילי על פי גדיל ה RNA DNA פולימראז משלים את גדיל ה DNA השני ליצירת cDNA דו גדילי

מאפיינים

Specific

הבדלים בין PCR, RT-PCR ו Realtime pcr

Lorem ipsum dolor sit

ניתן לבצע realtime PCR גם כאשר חומר המוצא הוא DNA ויש לזה שימוש במקרים מסויימים

סוגי גלאים לתוצר ב Realtime PCR

שיטה לא ספציפית

SYBR Green

ניתן לעקוב אחר כמות ה-DNA הנוצרת בכל מחזור שכפול בעזרת שני סוגי גלאים פלורוסנטים

TaqMan

שיטה ספציפית

SYBR Green

- נקשר לכל DNA דו גדילי ולא רק לרצף המוגבר - כאשר אינו קשור ל DNA פולט פלורוסנציה חלשה שאינה עוברת את ערך הסף - יש לדאוג לתחלים ספציפיים לרצף המוגבר ב - PCR אחרת עלול להיות זיהוי תוצרים לא ספציפיים

SYBR Green

בכל מחזור הכפלה תגבר עוצמת הפלורוסנציה

TaqMan

- שימוש בגלאי שנקשר באופן ספציפי לרצף שרוצים. - על הגלאי יש מולקולה פלורוסנטית ומולקולה אחרת שמדכאת את פליטת הפלורוסנציה - כל עוד שתי המולקולות קרובות לא תיפלט הפלורוסנציה - כאשר אנזים הפולימראז מאריך את הגדיל הוא מפריד בין המולקולות הקשורות לגלאי ונפלטת פלורוסנציה

יתרונות וחסרונות של שיטת realtime PCR

יתרונות

חסרונות

מאפשרת השוואת כמותית מדוייקת בין רמות ביטוי של מספר גנים בדגימות שונות

עלות גבוהה של המכשיר והחומרים בשיטה

מאפשר מעקב בזמן אמת אחרי רמת הביטוי של הגנים

חוסך זמן ומשאבים מכיוון שאין צורך להריץ את הדגימות בג'ל אלקטרופורזה

קריאה וניתוח התוצאות

שלבים בקריאת התוצאות

יוצרים עקומת כיול של פלורוסנציה כתלות בכמות DNA מסומן

לפי עקומת הכיול קובעים ערך סף פלורוסנציה אליו רוצים להגיע

--------------------------------------------------------------

קובעים לכל דגימה את הסבב בו רמת הפלורוסנציה שלה מגיעה לערך הסף - CT

ככל שערך CT הוא בסבב מוקדם יותר כך כמות ה cDNA גדולה יותר

כמות cDNA גדולה יותר נובעת מרמת ביטוי גבוהה יותר של mRNA בתאים הנבדקים

דוגמה לתוצאות realtime PCR

ניתן לראות בדוגמה תוצאת qPCR לבדיקת רמות ביטוי של mRNA בחמש תגובות שונות (שכל אחת מהן מסומנת בצבע שונה ובוצעה ב-3 חזרות). מניתוח התוצאות שהתקבלו ניתן להסיק כי הגן בעל הביטוי הגבוה ביותר מבין אלו שנבדקו הוא הגן המסומן בצבע ירוק ואילו הגן בעל ביטוי ה-mRNA הנמוך ביותר הוא הגן המסומן בצבע תורכיז

נרמול התוצאות

על מנת להשוות ביטוי של שתי דגימות צריך להקפיד שכמות ה mRNA הכללית בכל הדגימות תהיה שווה. כמו כן, יש לבדוק, בנוסף לביטוי הגן הנבדק, גם ביטוי של גן מנרמל

על מנת לנרמל את התוצאות בודקים את הביטוי של גן מנרמל גן מנרמל הוא גן שנועד לתחזוקה שוטפת של התא והוא מתבטא ברמה שווה בכל התאים את התוצאות מכמתים באופן יחסי לגן המנרמל

תודה על ההקשבה

האם יש שאלות?