PRÁCTICA SENCILLA: EXTRACCIÓN DE ADN

PRÁCTICA TRADICIONAL SENCILLA

EXTRACCIÓN DE ADN

UD 3

Empezar

3- Reactivos

2- Muestra

1- Introducción

ÍNDICE

4- Material

6- Procedimiento

5- Fundamento

7- Resultados

1.- INTRODUCCIÓN

Extracción de ADN

esto se realiza provocando la precipitación de las proteínas para poder extraer el ADN, que así podremos separar de la muestra.

El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular (también en mitocondrias, es el ADN mitocondrial). Para poder extraerlo es necesario romper las células y separar el núcleo, para después romperlo y liberar el ADN. Una vez liberado, el ADN, es necesario separarlo de las proteínas (citoplasmáticas e Histonas) y demás componentes celulares; Una vez extraído, lo podemos ver a simple vista, porque puede medir hasta 5 cm. Así podemos ver nuestro propio ADN.

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https://es.123rf.com/photo_49246514_la-lisis-celular-la-destrucci%C3%B3n-de-una-c%C3%A9lula-puede-ser-utilizado-para-ilustrar-el-efecto-de-los-medicame.html

2. Muestra 3. Reactivos 4. Material

Material: - Papel de filtro. - 2 vasos de plástico. - 2 tubos: uno de ensayo y uno Falcon ( uno para alcohol y otro para saliva). - 2 tubos eppendorf de 2mL. - Pipetas Pasteur. - Gradilla. - Cucharilla o espátula. - Parafilm. - Portaobjetos y cubreobjetos. - Microscopio Óptico.

Muestra: Saliva

Reactivos: Agua: Destilada o embotellada poco mineralizada. - Alcohol Etílico de 96º Frío (se deja en tubo tapado, en frigorífico a 4ºC). - Sal común: NaCl. - Detergente (lavavajillas, neutro, sin bactericida,…). - Alcohol de 70º. - Colorante: Azul de Metileno.

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5.- FUNDAMENTO

Para conseguir la extracción de ADN se utilizan los siguientes reactivos: - El DETERGENTE: Disuelve los LÍPIDOS y FOSFOLÍPIDOS de la pared y membrana celular, dejando libre el contenido celular que quedará suspendido en el agua. Disuelve proteínas de la membrana celular. - La SAL: Produce un medio HIPERTÓNICO, por lo que evita que los cromosomas se adhieran a ciertas proteínas y otros componentes celulares, y los iones Na+ neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato del ADN; se vuelve insoluble en agua y, como tiene menor densidad que el agua, flota sobre ella.

- El ALCOHOL 96º FRÍO: Al añadirlo al medio de forma suave, quedará sobre el agua, formándose una INTERFASE agua-alcohol donde se desplaza el ADN. El alcohol produce DESHIDRATACIÓN con lo que elimina las moléculas de agua de alrededor del ADN, con esta acción se coagula el ADN, acción que se acelera, se hace más rápida, por acción del frío, formándose unos hilillos esponjosos, entre la capa de agua y alcohol.

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6.- PROCEDIMIENTO

1.- Rotular los vasos y tubos con nombre o identificación. 2.- Preparar un tubo de ensayo con alcohol de 96º y ponerlo en nevera a 4ºC. 3.- Preparar la Solución de LISIS en un vaso rotulado. En 20 mL de agua verter: 1 gramo de sal. 2 gotas de detergente. Mezclar suavemente, para evitar la formación de burbujas, que impedirían visualizar el ADN.

SOLUCIÓN LISIS

ROTULAR

ETANOL 96 EN FRIO

6.- PROCEDIMIENTO

4.- Enjuagar la boca con agua, para eliminar restos de comida, se recomienda no haber comido, al menos, media hora antes de la toma de muestra . 5.- Enjuagar con 3 cucharadas de agua vigorosamente durante 30 segundos, para arrastrar el mayor número posible de células de descamación de la mucosa oral. 6.- Verter el agua de enjuague en el vaso de solución de lisis. 7.- Dejar actuar durante 10 minutos, agitando suavemente de vez en cuando, cada 2 minutos, para disolver los componentes celulares, sin formar espuma. 8.- Añadir un volumen igual a dos tercios, aproximadamente, de la solución anterior en tubo Falcon rotulado con tu nombre.

VERTER EN SOLUCIÓN LISIS (10 MIN REPOSO)

LAVAR BOCA

VERTER 2/3 EN TUBO FALCON

ENJUAGAR Y VERTER SALIVA CON AGUA

6.- PROCEDIMIENTO

9.- A continuación verter, la solución de alcohol de 96º frío, haciéndola resbalar suavemente por la pared del tubo inclinado.10.- Dejar reposar 2-3 minutos sin remover en absoluto. El alcohol formará una capa en la parte superior de la fase acuosa, entre las dos capas, se forma otra, la interfase, donde, pasados varios minutos (5-10 minutos) se va desplazando el ADN y coagulando, va precipitando por el frío y el alcohol y se visualiza la formación de hilillos esponjosos y una masa blanquecina, formando un grumo de aspecto algodonoso: ¡¡¡¡¡ Es tu ADN !!!!10.- Dejar reposar 2-3 minutos sin remover en absoluto. El alcohol formará una capa en la parte superior de la fase acuosa, entre las dos capas, se forma otra, la interfase, donde, pasados varios minutos (5-10 minutos) se va desplazando el ADN y coagulando, va precipitando por el frío y el alcohol y se visualiza la formación de hilillos esponjosos y una masa blanquecina, formando un grumo de aspecto algodonoso: ¡¡¡¡¡ Es tu ADN !!!!

SE FORMAN 2 FASES

AÑADIR ALCOHOL FRIO

EN LA INTERFASE ESTA TU ADN!!!!

REPOSO 2-3 MIN

6. PROCEDIMIENTO

11.- Tras unos minutos (3-5 minutos) el ADN se desplaza hacia el alcohol, entonces se recoge con una varilla de vidrio, un palillo o una pipeta Pasteur; para ello, se introduce la punta en la masa de ADN y se extrae suavemente mientras se hace un giro para enrollarlo.

12.- Mientras el ADN se desplaza a la interfase, preparamos 2 tubos eppendorf, marcados con el nombre, para conservar el ADN, donde ponemos 1,5 mL de alcohol de 70º. 13.- Una vez extraído el ADN, (sin mezclar ni tocar las paredes del tubo para evitar que se quede pegado el ADN al tubo), lo suspendemos en el alcohol de 70º de los tubos eppendorf, para su conservación.

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6. PROCEDIMIENTO

14.- En un tubo eppendorf con alcohol de 70º y ADN ponemos 1 gota de colorante (Azul de Metileno) agitamos suavemente, dejamos reposar 10 minutos a 37ºC o 15 minutos a temperatura ambiente. 15.- Preparamos 2 portaobjetos (limpios y desengrasados) y añadimos una gota de la disolución preparada con pipeta Pasteur. Colocamos un cubre, presionamos, eliminamos el liquido en exceso. 16.- Observar al Microscopio Óptico a 10X, 40X y 100X (con aceite de inmersión).

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6. PROCEDIMIENTO

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7.- RESULTADOS:

CURIOSIDADES:

El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro, ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción “profesional” se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN y que impiden que se unan al ADN (proteasa K). Proteinasa K libera el ADN nuclear al medio y destruye las proteínas. Se desproteiniza por deshidratación y precipitación por una solución saturada de NaCl, y finalmente se obtiene el ADN por precipitación con alcohol absoluto.

Una cadena de ADN puede medir perfectamente unos 5 cm: por eso son visibles a simple vista. Si juntáramos todas las cadenas de ADN que hay en una sola célula humana, superaríamos los de 2 metros de longitud, pero si alineáramos todas las cadenas de ADN de una persona, llegaríamos a superar los 100.000 millones de kilómetros !!!. O sea, la luz tardaría 4 días en recorrer esa distancia...

WEBGRAFÍA

https://eprints.ucm.es/id/eprint/4594/1/T26242.pdf https://www.monografias.com/trabajos91/informe-experimento-extraccion-adn/informe-experimento-extraccion-adn.shtml https://www.kapitalinteligente.es/extraccion-de-adn/ https://www.pngwing.com/es/free-png-vpznx https://www.parqueciencias.com/area-educativa/formacion-profesorado/extraccion-de-adn/ https://www.freepng.es/hd-png/epje.html https://inakiresa.wordpress.com/2011/12/06/extraccion-de-adn-y-observacion-al-microscopio/

FIN

- Elisa Casabán