PRESENTACIÓN SKETCH ANIMADO

Práctica 5

Extracción de ADN y electroforesis

Objetivo:

• El alumno (a) realizará la técnica de extracción de ADN a partir de un cultivo bacteriano. Comprenderá cada una de las etapas y la utilidad de cada reactivo empleado.

• Visualizará mediante electroforesis en gel de agarosa con la finalidad de conocer su utilidad en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y en investigación.

Introducción

Técnica primordial en todo laboratorio de docencia e investigación. Aplicaciones: Diagnóstico de enfermedades infecciosas Diagnóstico de enfermedades hereditarias Clonación Medicina forense Análisis taxonómico Secuenciación Vacunas ADN Farmacogenómica

La elección del protocolo depende de:

Fuente a partir del cual se desea obtener el ADN (tejidos, cultivo bacteriano o celular, alimentos)

Aplicación final (PCR, secuenciación, ensayos de interacción proteína-ADN)

Tipo de ADN (genómico, plasmídico, de virus)

Se utilizará el método de Tiocianato de guanidina descrito por Pitcher y col. en 1989

3 Etapas

Etapa 3

Etapa 1

Etapa 2

Purificación

Lisis celular

Inactivación de nucleasas

Solución de lisis

Tiocianato de guanidina: Agente caotrópico, que tiene afinidad por las proteínas de la membrana desnaturalizándolas; N-sarcosyl: Detergente que desnaturaliza proteínas ayudando a la lisis, destruyendo algunas nucleasas liberadas y tiene afinidad por los lípidos. EDTA (ácido etilenodiaminatetraacético): Actúa como un potente quelante de cationes de Ca++, Mg++, Mn++. De esta manera, las nucleasas dependientes de iones carecerán de actividad evitando asi la degradación del ácido nucleico.

II

II1

Purificación

Fase 3

Fase 1

Fase 2

Lavado de la pastilla y recuperación de ADN

Precipitación de proteínas

Precipitación de ADN

Precipitación de proteínas

DATOS

Acetato de amonio a 7.4M, precipita las proteínas "salinizado de proteínas o saling out" Concentración alta: disminuye solubilidad Cambia la estructura de las proteínas, por lo que dejan de estar disueltas en el líquido volviéndose insolubles, facilitando su eliminación. También son eliminadas las nucleasas. El cloroformo con alcohol isoamílico permite separar el material nucleico disuelto en agua de las proteínas, detritos celulares y lípidos que son disueltos en el cloroformo, separando así en tres fases la mezcla.

Precipitación del ADN

El etanol absoluto precipita el ADN. El alcohol disminuye la la solubilidad del ADN, que en presencia de altas concentraciones de sales, precipita. Al ser adicionados y después de una centrifugación es posible eliminar el agua y compactar el ADN en una pastilla; sin embargo, este procedimiento es tan rápido que el material nucleico pueda quedarle remanentes de sales provenientes del citoplasma bacteriano y de las soluciones empleadas durante la extracción.

Lavado de la pastilla y recuperación del ADN

Por esta razón, el lavado de las pastilla para eliminar impurezas se realiza con etanol diluido al 70% con agua para que esa pequeña cantidad de agua solubilice las sales remanentes y el etanol precipite únicamente el ADN.

Por ultimo, el sedimento se reconstituye en agua o amortiguador Tris tras ser secado completamente. Una vez reconstituido el ADN se puede mantener en congelación de tres meses a cinco años según el microorganismo en cuestión. Si va a emplearse para uso cotidiano puede ser almacenado en refrigeración a 4°C.

Ejercicio

ELECTROFORESIS

Es el movimiento y la separación de una partícula con carga bajo la influencia de un campo eléctrico.

En un extremo, el gel tiene pozos en donde se colocaran las muestras de ADN. Una fuente de poder confiere el voltaje y el amperaje necesario para que la muestra puede migrar.

Reactivos:

Gel de agarosa: Polímero obtenido a partir de las algas rojas, que tras fundirse en una solución amortiguadora acuosa, y deja enfriarse se forma un gel.

La migración de la partícula es determinada por el tamaño, forma y la carga, así como la temperatura. Los fragmentos mas cortos de ADN se mueven mas rápido a través de los poros de la matriz del gel que los fragmentos mas grandes.

Soluciones amortiguadoras Los mas empleados son: TAE (Tris-ácido acético-EDTA), moléculas grandes TBE (Tris-ácido bórico-EDTA) plásmidos SB (Sodio en hidróxido y ácido bórico) moléculas pequeñas (Productos de PCR o digestión enzimática)

Amortiguador de carga Es una referencia visual que permite apreciar el movimiento de las muestras a través de gel. Así mismo, en su composición existe algún carbohidrato que confiere densidad a la muestra para que esta no difunda por la solución de corrida. Los colorantes empleados para este compuesto son cianol de xileno, azul de bromofenol y naranja G.

Marcador molecular Los marcadores de longitud, son fragmentos de ADN de referencia (comúnmente comerciales) con tamaños de pares de bases conocidos.

Bromuro de etidio Para poder visualizar el material nucleico en el gel es necesario teñirlo. El bromuro de etidio, pigmento anaranjado que se intercala en las bases nitrogenadas. Posteriormente debe ser expuesto a las luz ultravioleta la cual excita la partícula del fluorocromo y este emite fluorescencia.

SYBR green El SYBR Green no es un agente intercalante, ya que no se inserta en el espacio entre dos pares de bases, sino que se asocia a la molécula de ADN interactuando con la hendidura menor del ADN.

Transiluminador El fragmento fluorescente de ADN puede ser observado y analizado en un transiluminador de luz UV, de acuerdo a su tamaño y migración para evaluar tres características:

El fragmento fluorescente de ADN puede ser observado y analizado de acuerdo a su tamaño y migración para evaluar tres características:

1) Pureza 2) Rendimiento 3) Integridad

No presente contaminantes

Concentración necesaria para llevar a cabo nuestro procedimiento.

Reacción de la cadena de la polimerasa

Reacción de la cadena de la polimerasa.

¡Gracias!

Ejercicio: http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof2.html

Tecnologías

Reacción en cadena de la polimerasa Ensayos de digestión con enzimas de restricción

Enfermedad de Lyme

Borrelia burgdorferi, bacteria responsable de la enfermedad de Lyme, los anticuerpos no se desarrollarán hasta entre cuatro y seis semanas después de que la garrapata haya transmitido la bacteria y los títulos pico pueden ocurrir meses después. En cambio, con la PCR se podría detectar de forma muy temprana.