4. BTC-426 Cultivo de células y tejidos vegetales

Cultivo de tejidos y células vegetales

Conceptos básicos

Totipotencia celular

Gottlieb Haberlandt (1854 - 1945)

Resistencia a estrés ambiental

Mayores rendimientos

Resistencia a plagas y enfermedades

Cultivo in vitro

Rol del cultivo in vitro en la biotecnología vegetal

Células degeneradas (elementos vasculares, tubos cribosos)

Células de pared celular gruesa (colénquima, células lignificadas)

Células acompañantes (parénquima) y células secretoras

Ápice vegetativo

Cambium

Células fibrosas (prosénquima)

Parénquima

De células a embriones

Reprogramación celular

División celular y citodiferenciación

División celular y citodiferenciación

Diferentes técnicas de cultivo in vitro

Medios de cultivo

Medios nutritivos para cultivo in vitro de células y tejidos vegetales

• Fuentes de carbono
• Sales inorgánicas
• Suplementos orgánicos
• Elementos traza
• Factores de crecimiento (fitohormonas)

Fuentes de carbono

• Sacarosa/glucosa (2-5%)
• Lactosa, galactosa, maltosa y almidón son menos efectivos que la sacarosa o la glucosa
• Glucosa más efectiva que fructosa
• Sacarosa esterilizada en autoclave era mejor que sacarosa esterilizada por filtración
• Suplementos de melaza de caña de azúcar, extracto de plátano y agua de coco pueden ser una buena alternativa para reducir costos
• Fuentes de vitaminas e iones inorgánicos

Macronutrientes

• Concentraciones mayores a 0.5 mM.
• Nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg) y azufre (S).
• Al menos 25-60 mM de nitrógeno inorgánico.
• K en forma de sales de cloruro ó nitrato (20 y 30 mM).
• P, Mg, S y Ca entre 1 y 3 mM

Micronutrientes

• Concentraciones menores a 0.5 mM.
• Hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B), cobre (Cu) y molibdeno (Mo).
• Citrato o tartrato de Fe tienen dificultad para disolverse y pueden precipitar después de la preparación del medio.
• Se prefiere ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) -quelato de hierro (FeEDTA).
• Cobalto (Co) y yodo (I) suelen ser opcionales.
• Sodio (Na) y cloro (Cl) no son esenciales.

• Cu y Co a 0.1 µM.
• Fe y Mo a 1 µM.
• I a 5 µM.
• Zn a 5-30 µM.
• Mn a 20-90 µM.
• B a 25-100 µM.

Vitaminas y mioinositol

• Tiamina (B1), ácido nicotínico y piridoxina (B6).
• Tiamina (B1) a 0.1 - 10 mg/L.
• Ácido nicotínico a 0.1 - 5 mg/L.
• Piridoxina (B6) a 0.1 - 10 mg/L.
• Biotina, ácido fólico, ácido ascórbico, ácido pantoténico, tocoferol (vit. E), riboflavina, ácido p-amino-benzoico se utilizan pero no son factores limitantes del crecimiento
• Cuando exista baja concentración de tiamina.
• Cuando se requiera densidades de población bajas.

• Mioinositol ya no se considera una vitamina (B8) sino un carbohidrato.
• Estimula el crecimiento celular.
• A 50 - 5000 mg/L.

Aminoácidos

• Particularmente importante para establecer cultivos de células y protoplastos.
• Fuente de nitrógeno de asimilación más facil.

• Caseína hidrolizada a 0.25 - 1 g/L.
• L-glicina a 2 mg/L.
• L-glutamina hasta a 8mM.
• L-asparagina a 100 mg/L.
• L-arginina a 10 mg/L.
• L-cisteína a 10 mg/L.
• L-tirosina a 100 mg/L.

Suplementos orgánicos

• Hidrolizados de proteínas, leche de coco, extracto de levadura, extracto de malta, plátano molido, jugo de naranja, jugo de tomate, etc.
• Carbón activado a 1% para adsorción de compuestos inhibidores o para el oscurecimiento del medio.

Agentes gelificantes

• Agar
• Agarosa
• Goma gellan

• Gelrite TM
• Phytagel TM
• Carragenina (gelificante alimenticio)

Soportes para medios líquidos

Reguladores de crecimiento

Alargamiento del tallo, tropismo y dominancia apical.

• Auxinas
• Citoquininas
• Giberelinas
• Ácido abscísico.

Auxinas

• Ácido indol-3-acético (IAA)
• Ácido indol-3-butírico (IBA)
• Ácido 2,4-diclorofenoxi-acético (2,4-D)
• Ácido 4-clorofenoxi acético (4-CPA)
• Ácido p-cloro-fenoxi acético (pCPA)
• Ácido 2,4,5-tricloro- fenoxiacético (2,4,5-T)
• Ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico (dicamba)
• Ácido 4-amino-3,5,6-tricloro-picolínico (picloram)

Auxinas

• NAA y 2,4-D son estables y pueden almacenarse a 4°C durante varios meses (o a -20°C).

• IAA es mejor preparar soluciones nuevas cada vez aunque se puede almacenar en una botella ámbar a 4°C durante máx. 1 semana.

• IAA y 2,4-D se disuelven en EtOH al 95%.

• NAA, 2,4-D e IAA se disuelven en NaOH 1N.

• 2,4-D es 8X - 12X más activo que IAA
• 2,4,5-T es 4X más activo que IAA
• NAA es 2X más activo que IAA
• Estimulan la producción de callos y el crecimiento celular.
• Iniciar los brotes y el enraizamiento.
• Inducen la embriogénesis somática.
• Estimulan el crecimiento de los brote apicales en cultivo de tallos.

Citoquininas

• BAP (6-benciloaminopurina)
• 2iP (6-dimetilaminopurina) (natural)
• Kinetina (N-2-furanilmetil-1H-purina-6-amina)
• Zeatina (6-4-hidroxi-3-metil- trans-2-butenilaminopurina) (natural)
• TDZ (tiazurón-N-fenil-N-1,2,3 tiadiazol-5ilurea).

Citoquininas

• Relativamente estables en medios de cultivo.
• Pueden almacenarse desecados a -20°C.
• Difíciles de disolver (HCl 1N, NaOH 1N o DMSO facilitan su disolución).
• DMSO actúa también como agente esterilizante (puede añadirse directamente al medio de cultivo estéril).

• Zeatina es más eficaz que 2iP.
• Estimulan la división celular.
• Inducen la formación de brotes y la proliferación de brotes axilares.
• Retardan la formación de raíces.

Efectos del balance entre auxinas y citoquininas

Auxinas

Citoquininas

Enraizamiento en tallos

Enraizamiento en callos

Formación de callos

Desarrollo de brotes adventicios

Desarrollo de brotes radiculares

Combinaciones y concentraciones sugeridas

https://doi.org/10.1105/tpc.114.133595

Ácido abscisico (ABA)

Giberelinas

• GA3 (ácido giberélico) es la giberelina más utilizada.
• Mejoran el crecimiento de callos.
• Ayudan al alargamiento de plántulas enanas .

• Inhibe o estimula el crecimiento de callos, dependiendo de la especie.
• Mejora la proliferación de brotes.
• Inhibe las etapas posteriores del desarrollo del embrión.

VS

Manejo del etileno

• Nitrato de plata (AgNO3)
• Aminoetoxivinilglicina (AVG)
• Tiosulfato de plata (STS)

Medios y prácticas para cultivo de tejidos vegetales: Una visión general

https://link.springer.com/article/10.1007/s11627-019-09983-5

Preparación de medios de cultivo

Medios basales comunes

https://www.sigmaaldrich.com/BO/es/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/plant-tissue-culture/growth-regulators

Soluciones Stock

• Macronutrientes 10X @ 2°C - 4°C.
• Micronutrientes 100X @ 2°C - 4°C.
• FeEDTA 100X @ 2°C - 4°C.
• Vitaminas 100X - 1000X @ -20°C ó 2 - 3 meses @ 2°C - 4°C y luego desechar.
• Reguladores de crecimiento 100X - 1000X @ 2°C - 4°C.

Soluciones Stock

Soluciones Stock

Instalaciones para cultivo de tejidos vegetales in vitro

• 16 h luz
• 22–25°C.
• Intensidad de 25-50 μmol m−2 s−1
• Luz blanca fría.
• HR 50% - 60%

Equipos necesarios

Procesos

Sala de preparación

Sala de transferencia

Sala de crecimiento

• Autoclave
• Destilador
• Lavabo doble
• Calentador/agitador magnético
• pH-metro
• Balanzas
• Horno secador
• Microondas
• Refrigerador
• Carrito transportador
• Estantes/armarios

• Cámara de flujo laminar
• Mesones
• Bomba peristáltica
• Sillas de altura ajustable
• Mecheros
• Microscopio binocular
• Microscopio compuesto
• Shaker orbital de baja velocidad

• Azulejos blancos
• Piso de linoleo
• Estantes inoxidables
• Iluminación artificial
• Aire acondicionado
• Termómetro de máximas y mínimas
• PAR-metro

Recipientes de cultivo

Aclimatación

Asepsia en le cultivo de tejidos vegetales

Bacterias

Virus

Organismos contaminantes

Hongos

Artrópodos

Levaduras

Bacterias

• Contaminantes más frecuentes.
• Por lo general, se introducen con el explante (tejidos internos o esporas en la superficie).
• Pueden sobrevivir a la esterilización superficial del explante
• Contaminación se manifiesta mucho después de iniciado un cultivo.
• Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Enterobacter, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Xanthomonas, etc.
• "Exudado" característico, de muchos colores (blanco, crema, rosa, amarillo).
• Olor distintivo.

Hongos

• En los explantes o pueden ser transportadas por el aire.
• Patógenos de plantas y saprófitos del suelo.
• Apariencia "algodonosa".
• Diversidad de colores.

Levaduras

• Contaminante común.
• Superficies externas de las plantas
• A menudo presentes en el aire.

Artrópodos

• Los más problemáticos son hormigas, trips y ácaros.
• Los trips a menudo ingresan a los cultivos como huevos presentes en los explantes.
• Hormigas y ácaros suelen infestar cultivos ya establecidos.
• Ácaros se alimentan de hongos.
• Infestaciones de ácaros se detectan por líneas de infección por hongos que van desde el borde del recipiente de cultivo hasta el tejido de la planta.
• Muy difíciles de erradicar las infestaciones de insectos.
• Prácticas de laboratorio cuidadosas y la limpieza como prevención.

Contaminantes iniciales

• La mayor parte de la contaminación.
• Se introduce con el explante.
• Esterilización inadecuada.
• Material vegetal muy sucio.
• Fúngico o bacteriano.
• Más problemático cuando el explante se recolecta del campo o del invernadero.
• Evidente a los pocos días de iniciados los cultivos.
• "Exudado" en medio sólido y turbidez en cultivos líquidos.
• Micelio de hongos en medio sólido y pequeñas masas en medio líquido.

Contaminación introducida

• Técnica estéril deficiente.
• Condiciones sucias de laboratorio.
• Se puede prevenir en gran medida con el cuidado adecuado.

Contaminación latente

• Suele ser bacteriana.
• Se observa mucho después de que se inician los cultivos.
• Bacterias endófitas no patógenas.
• Una vez in vitro, su número aumenta y se apodera de los medios de cultivo.
• Particularmente peligrosa porque se puede transferir fácilmente entre cultivos.

Detección de contaminantes

• Detección visual en laboratorios de investigación.
• Detección documentada en entornos comerciales.
• Tomar una parte del tejido vegetal y cultivarlo en medios específicos para bacterias y hongos.
• PDA (papa dextrosa agar) para hongos.
• Caldo NB (con sales, extracto de levadura y glucosa) para bacterias.
• Más confiable para detectar bacterias y hongos, pero hay organismos infecciosos que no se detectarán.

Cámara de flujo laminar

• Filtro HEPA (High Energy Particle Air) de 0.3 micrómetros.
• Velocidad uniforme de 90 pies/min en toda la superficie de trabajo.
• Flujo laminar (sin turbulencias)
• Excluye esporas de bacterias y hongos → aire estéril.
• Presión positiva del flujo de aire evita la entrada de esporas de hongos o bacterias.

Esterilización

Filtración

Autoclave

• 115°C - 135°C.
• Método rápido y simple
• Cambios de pH del medio
• Algunos componentes pueden descomponerse y perder su efectividad.

• Fltros Micropore (0.22 - 0.45)
• Componentes orgánicos termolábiles (vitaminas, reguladores del crecimiento, aminoácidos).

• VS

Autoclavado

• Método más utilizado (materiales resistentes al calor) y habitual.
• 121°C, 15 psi, durante al menos 15 minutos.
• Alcanzar temperatura y presión y recién contabilizar el tiempo.
• La mayoría de los autoclaves ajustan automáticamente el tiempo e incluyen el tiempo en el ciclo para una disminución lenta de la presión.
• Indicadores de cinta, "kits de prueba" de microorganismos.
• Recipientes vacíos deben cerrarse con una tapa o papel de aluminio.
• Herramientas (pinzas, mangos de bisturí, etc.) deben envolverse en papel de aluminio o papel o colocarse en una bandeja de esterilización cubierta.
• El vapor debe penetrar en los materiales.

Autoclavado y esterilización por filtración de medios de cultivo y otros líquidos

• Esterilización en autoclave y filtración por membrana a presión positiva.
• Medios de cultivo, agua destilada y otras mezclas termoestables se pueden esterilizar en autoclave en recipientes de vidrio sellados con tapones de algodón, papel de aluminio o tapas de plástico (polipropileno).
• Pequeños volúmenes (100 ml o menos) → 15 a 20 min.
• Volúmenes grandes (2 a 4 L) → 30 a 40 min.
• Presión no debe exceder los 20 psi
• Descomposición de carbohidratos.
• Cambios en las propiedades del medio.

Autoclavado y esterilización por filtración de medios de cultivo y otros líquidos

• Soluciones con componentes termolábiles deben esterilizarse por filtración (reguladores de crecimiento, aminoácidos y vitaminas).
• Filtración a través de una membrana de 0.22 μm.
• Membranas de nitrocelulosa pueden esterilizarse en autoclave.
• Unidad de filtrado y filtro se esterilizan como una sola pieza.
• Los más grandes se colocan sobre un matraz estéril y se aplica vacío.
• El tamaño del filtro depende del volumen de la solución a esterilizar.
• Para medios nutritivos, los componentes termoestables se esterilizan en autoclave y luego se enfrían a 35°C-50°C, componentes termolábiles se esterilizan por filtración y se combinan en condiciones asépticas.
• Algunos compuestos termolábiles se pueden autoclavar si se determina que los resultados son fiables y reproducibles (ABA, IAA, IBA, kinetina, piridoxina, 2-ip y tiamina).

Otros métodos de esterilización

• Gas de óxido de etileno:
• Recipientes de plástico que no se pueden calentar.
• Ya se venden estériles y no se pueden reesterilizar.
• Placas Petri de plástico, tubos de centrífuga de plástico, etc.
• Radiación UV:
• En la cámara de flujo laminar cuando nadie está trabajando allí.
• Microondas:
• Materiales.

Cultivo de tejidos vegetales en la práctica

Gracias!