Descubriendo una glicoproteína

Descubriendo

una glicoproteína

La historia de la H,K-ATPasa

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Te invitamos a seguir los pasos de un grupo de investigadores que intentaron descubrir si una ATPasa conocida se asociaba, para su funcionamiento, a una glicoproteína.A lo largo de las misiones te enfrentarás a los detalles experimentales de la investigación y a sus resultados, y pondrás a prueba tu conocimiento en glicómica. Buena suerte!

El artículo

Módulo Hidratos de Carbono

Una subdivisión de Química Biológica (FFyB, UBA)

Estos son nuestros docentes

(cualquier parecido con la realidad es pura coincidencia)

Introducción

• La H,K-ATPasa se encuentra en las células parietales.
• Es responsable de la secreción del ácido gástrico (mata la mayoría de los gérmenes en la comida y activa el pepsinógeno para la digestión de proteínas).
• Transporta H+ y K+ en contra del gradiente y consume ATP.
• Ahora sabemos que posee 2 subunidades (α y β).
• La sub α une los ligandos, y por eso se pensó durante mucho tiempo que era una única subunidad.

¿Por qué buscar otra subunidad?

• Se conocía que las proteínas de una misma familia suelen ser muy similares estructuralmente, y que la H,K-ATPasa pertenece a la familia de las P-ATPasas de tipo II, al igual que la Na,K-ATPasa que posee una subunidad β muy glicosilada.
• Además, había glicoproteínas en las vesículas donde se almacenaba la H,K-ATPasa (visto por histología).

(clave)

Mapa

(o pasos a seguir)

Deberás seguir los pasos del grupo de Forte para descubrir si la H,K-ATPasa tiene o no una subunidad β.Muchas de las respuestas están en el artículo, pero también podés usar tu conocimiento en glicómica, lo que prefieras!Al final descubrirás una frase que deberás compartir en el campus o redes sociales.

1. Misión 1. Materiales y Métodos.

2. Misión 2. ¿Es una glicoproteína?

3. Misión 3. Caracterización parte 1.

4. Misión 4. Caracterización parte 2.

5. El código.

Revisemos un poco los materiales y métodos. ¿Cuanto se relacionan con lo que sabés hasta ahora?

¿Qué método utilizan para cuantificar proteínas totales?

Bradford

Western blot

Absorbancia

En efecto! lo hacen por Bradford y usanγ-globulina como estándar. También te deben sonar los nombres de las proteínas que forman el marker del SDS-PAGE, no? Tomá nota de eso para la clase.

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¡Que lo anotes!

Ahora sí, sigamos....

En un momento mencionan una determinación de hexosas (usando galactosa como estándar), ¿qué método aplican?

Somogy-Nelson

Orcinol

ROE

¡¡¡#*!ppkgfisk#**!! ¿Queeeeeé? ¿Orcinol??????!!!

Sí! No estamos locos, ni nos confundimos! En ciertas condiciones se puede utilizar este método para detectar hexosas. No te preocupes! en nuestros ejercicios, nosotros siempre vamos a usar el método de orcinol para PENTOSAS. (Pst! anotalo!)Si querés recordar la reacción, pasá el puntero por acá.

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¿Estas usando el paper? Si es así, fantástico! Avancemos...

¿Qué método usan para teñir H de C?

PAS

Alcian blue

Tinción de plata

Claro!! En realidad el paper indica "periodic acid-danzyl hydrazine", que es una especie de tinción de PAS, pero fluorescente.También si revisás, vas a ver que usan Coomasie blue para teñir proteínas

Más info sobre PAS

Más info sobre este método

(Buscá esta sección en el seminario)

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Seguí así, vas por buen camino

En la sección "Lectin affinity chromatography of hog gastric microsomal glycoproteins" de MyM, mencionan una columna llamada WGA ¿qué utilizan para la elución?

Galactosa

N-acetilglucosamina

Sí! Esta columna de lectinas tiene afinidad por N-acetilglucosaminas, en cambio, la columna RCA tiene afinidad por galactosa.Cuando en el Western blot señalan que usan HRP-WGA o HRP-RCA, están buscando que las lectinas detecten esos azúcares, para luego poder revelarlo (también usan un anti-H+/K+-ATPase monoclonal antibody, ¿para qué?)

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La última de MyM

Llegando al final señalan una deglicosilación utilizando TFMS. Este es un tipo de hidrólisis química que entre otros, corta enlaces O-glicano, ¿de qué otra manera llamamos a esta reacción?

Hidrazilación

β-eliminación

¡Tal cual! es una β- eliminación. La reacción de hidrazilación corta los enlaces de tipo N-glicano.No te olvides de repasar qué otros tipos de hidrólisis existen y cómo se pueden utilizar para determinar la estructura primaria de los oligosacáridos.

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Misión 1

Misión 3

Bloqueada

Misión 2

Bloqueada

Misión 4

Bloqueada

Misión 1

Misión 2

Misión 3

Completa

Bloqueada

Misión 4

Bloqueada

Buscá la H,K-ATPasa oculta...

La 1ra cromatografía que presentan, la realizan en una columna de lectinas (WGA) equilibrada en presencia de NP40, un detergente no iónico con bajo poder desnaturalizante (pasá el puntero para ver su estructura).

Tenés que responder unas preguntas antes...

En el gel que revela proteínas vemos: Marcadores Mtra: Muestra total antes de sembrar NR: Fracción no retenida en la columna E: Fracción que se libera luego de la elución con N-acetilglucosamina

¿Qué peso tiene la banda de H,K-ATPasa?

87 kDa

94 kDa

200 kDa

Scanner

Así es. Los investigadores señalan que: "The most prominent Coomassie blue-staining protein band in purified microsomes (lane 2) is the 94 kDa H+/K+-ATPase (...) Under the prescribed conditions, the gastric H+/K+-ATPase is exclusively recovered in the WGA-binding fraction (lane 4)." Es decir que la banda de H,K-ATPasa es la de 94 kDa y queda retenida en la columna hasta que se eluye con N-acetilglucosamina.

¿Por qué?

Porque hay una parte glucosídica que interacciona con la lectina pero el detergente NP40 la disocia

Porque hay una parte glucosídica y el detergente NP40 no interfiere en la interacción entre ambas proteínas

Porque no hay parte glucosídica

Cuando usan el detergente DTAB (catiónico, más fuerte), observan que la proteína no se retiene en la columna, sale con el NR. Aunque sí ven bandas que solo se liberan (E) con la N-acetilglucosamina (son GPs). DTAB podría estar interfiriendo en la interacción de la H,K-ATPasa con la lectina (H,K-ATPasa sería una GP por sí misma), o interfiere en su interacción con una GP (que se une a la lectina).

Ahora siembran en NP40 (calle 2: NR, la ATPasa no salió, entonces quedó retenida!), lavan y hacen una primera elución con DTAB (eluye la proteína), y luego otra con N-acetil glucosamina (eluyen más proteínas).Refuerzan la hipótesis de que DTAB interfiere con alguna interacción.

Cromatografían en DTAB (calle 2, la proteína sale en el NR). Eluyen con N-acetilglucosamina (calle 3, sale el resto de las proteínas).Cambian el buffer de lo que recuperaron de la calle 2, lo pasan a NP40 (por diálisis) y ahora siembran (calle 4), la proteína NO se retiene (sale en NR)!!!! ¿por qué?

¿Qué interacción interrumpe el DTAB?

Claro! el DTAB no interfiere en las interacciones de las GPs con las lectinas, solo en interacciones entre proteínas.Luego del tratamiento con DTAB, las GPs quedaron retenidas en la matriz, en tanto que la H,K-ATPasa (que no es una GP) siguió de largo. Cuando usaron NP40 (calle 4), la ATPasa no pudo retenerse como hacía antes, porque en la muestra ya no estaban las GPs con las que interactuaba.

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Claro! el DTAB no interfiere en las interacciones de las GPs con las lectinas, solo en interacciones entre proteínas.Luego del tratamiento con DTAB, las GPs quedaron retenidas en la matriz, en tanto que la H,K-ATPasa (que no es una GP) siguió de largo. Cuando usaron NP40 (calle 4), la ATPasa no pudo retenerse como hacía antes, porque en la muestra ya no estaban las GPs con las que interactuaba.

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¿Cuál era el código?

Misión 2

Misión 3

Completa

Completa

Misión 4

Bloqueada

Mensaje escrito con tinta invisible e inteligente: si respondés bien, se revela el mensaje

Se realizó una inmunoprecipitación para determinar cuál de todas las GPs interactuaba con la ATPasa ¿qué peso tiene la GP que encontraron?

94-100 kDa

60-80 kDa

35-45 kDa

Revisá la Figura 7 del artículo y decidí si la GP que interactúa con la ATPasa es una proteína de membrana (como en este esquema) o si sólo está interactuando con la otra cadena sin estar inmersa en la membrana.

¿Es una GP de membrana?

No

Si

Al realizar una proteólisis es de esperar la aparición de varios fragmentos de bajo PM como consecuncia de la acción sobre los diversos sitios de corte. Que una proteína ofrezca resistencia al tratamiento, ya sea total o parcial, indica que esos sitios están protegidos. En este caso se observa protección parcial y la conclusión es que se trata de una proteína de membrana, ¿se te ocurre cómo relacionar esas afirmaciones?

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Misión 2

Misión 3

Completa

Completa

Completa

Misión 4

MW de la GP

Los investigadores sembraron en este gel:1) el Marker. 2) La muestra sin tratar (la GP aislada). 3) La muestra luego de un tratamiento que corta enlaces tipo O-glicano y N-glicano.

El peso de la parte proteica de la GP es:

32 kDa

Los autores indican que este experimento no es concluyente

67 kDa

Tipo de oligosacáridos

En el trabajo se menciona la siguiente frase:"When electrophoretically purified gp 60-80 was deglycosylated by Endo F (an enzyme which hydrolyzes only N-linked oligosaccharides), a 32 kDa core peptide appears as the major digestion product (Fig. 9), (...)"

Si lo relacionamos con lo que conocemos hasta ahora de la GP ¿Qué significa esta información?

Que posee una mezcla de ambos

Que la GP posee solo N-glicósidos

Que la GP posee solo O-glicósidos

La estequiometría ATPasa:GP es 1 : ?

Claro! La calle 8 del gel muestra que después de 7 h de tratamiento con Endo F solo se ven 2 bandas: H,K-ATPasa (94 kDa), de intensidad 3, y la parte proteica de la GP (32 kDa), de intensidad 1. Como la intensidad es proporcional a la cantidad de muestra, pero también a su tamaño, dividen cada valor por el MW. Luego calculan cuánta ATPasa (sub α) hay por GP (sub β): Proporción = (3/94 kDa) / (1/32 kDa) = 1

No, no...

Tratá de nuevo!

Claro!! 1:1. Ahora, ¿en qué año se publicó el trabajo?

(año de publicación, no de envio)