Curvas de calibración

Curva estándar de calibración

Dra. Rebeca García

Ejemplo de aplicación

¿Cómo cuantificar una muestra de concentración desconocida?

Curva estándar de un compuesto conocido

• Dilucion en serie de un estandar externo
• Funciona muy bien cuando no hay efectos de matriz ejercidos sobre la señal analítica o problemas de recuperación durante la preparación de la muestra
• Se prepara una solución base la cual se diluye en serie para proporcionar varias muestras de concentración variable
• Las muestras se analizan de acuerdo con procedimientos establecidos y se obtiene una repuesta (absorbancia, area, altura del pico, color)

Curva estándar

Regresión lineal para obtener la pendiente

• Dilución en serie de un compuesto
• El eje X es la variable independiente
• El eje Y es la variable dependiente
• Determinación de la pendiente
• Ecuación de la línea: Y = mX + b
• Para determinar la concentración en la muestra desconocida, ¿para que variable se resuelve la ecuación?

Otros métodos de cuantificación

Adición de estandar (fortificación de muestras)

• Muchas veces la respuesta de un análisis es alterada (aumentada o disminuida) por otros componentes de la matriz que se esta analizando.
• Este fenómeno se denomina un efecto de matriz en la muestra.
• Cuando se produce este efecto, el método de estándares externos (dilución en serie) no funciona correctamente

Ejemplo: Determinación de fenólicos totales

• 2.0 g de mora azul liofilizada fueron homogenizados con 15 mL de metanol.
• El extracto metanólico se utilizó para determinar la concentración de compuestos fenólicos totales en la fruta mediante el ensayo de Folin-Ciocalteu (F-C).
• La mora azul tiene un % de humedad del 75%.
• La absorbancia del extracto metanólico sin diluir (Solución A) sometido al ensayo F-C fue de 1.
• Posteriormente se tomó 1 mL del extracto metanólico concentrado (Solución A) y se diluyó con 9 mL de metanol obteniéndose la Solución B, cuya absorbancia fue de 0.2531 al someterla al ensayo de F-C.

Ejemplo: Determinación de fenólicos totales

• ¿Cuál es la concentración de compuestos fenólicos totales por g de mora azul en base seca y base húmeda? Para tus cálculos, utiliza los siguientes datos obtenidos de absorbancias a distintas concentraciones de ácido gálico:

Otros métodos de cuantificación

Adición de estandar (fortificacion de muestras)

• En este método alternativo se adiciona un estándar a la muestra, el cual aumenta la señal de respuesta de 2-4 veces (también conocido como “standard spiking”).
• Las muestras con éstandar adicionado se analizan en comparación con un “blanco de la muestra” sin estándar agregado y se obtiene una curva estándar por substracción

Adición de estandar (fortificacion de muestras)

Otros métodos de cuantificación

Estándar interno

• Algunas veces hay parámetros experimentales incontrolables que aumentan la variabilidad en la respuesta instrumental
• Los estándares y muestras se adicionan con alguna substancia a una concentración conocida (que no ocurra naturalmente en la muestra) y dicha substancia actúa como estándar interno
• Comunmente utilizado con GC y HPLC.
• La respuesta instrumental de este “estándar interno” se utiliza para normalizar la respuesta de las muestras que se están analizando.

Otros métodos de cuantificación

Estándar interno

• Características de un buen IS:
• Debe de lograrse su completa separación de otros picos
• Su tiempo de retención debe de ser cercano al del compuesto de interés
• Su estructura química debe de ser similar a la del analito de interés

Otros métodos de cuantificación

Estándar interno