β-GLUCOCEREBROSIDASA

β-GLUCOCEREBROSIDASA β-GLUCOSIDASA ÁCIDA

Judith Vázquez Hernández Biología Molecular Aplicada Maestro: Gilberto Velázquez Juárez

Empezar

A 14 de mayo del 2021

β-GLUCOCEREBROSIDASA

La β-glucosidasa es una enzima lisosomal que se encarga de catalizar la hidrólisis del enlace β -glicosÍdico de glucosilceramida (GlcCer) produciendo glucosa y ceramida

ESTRUCTRA QUÍMICA Y ESTRUCTURAL

HidrolasaHomo Sapiens Tiene dos cadenas de 497 aminoácidos cada una

Escribe un título AQUÍ

Tiene un cofactorC8H15NO6

Su estructura cuenta con hélices alfa y láminas beta

EC 3.2.1.45

Pesa 113.37 kDa

+ in

ENFERMEDAD DE GAUCHER

Es un desorden lisosomal hereditario, hay una mutación en el gen GBA1 situado en el cromosoma 1, causando una deficiencia en la actividad de la β-glucosidasa ácida resultando en la acumulación progresiva de glucosilcermaida y glucosilesfingosina en los lisosomas de macrófagos. Los síntomas son: hepatoesplenomegalia, trombocitopenia, anemia, anomalías de la coagulación y enfermedad ósea. En la población mundial pasa en 1/50,000 nacimientos

Los macrófagos se transforman en células de Gaucher, que se infiltran en la médula ósea, hígado y bazo

APLICACIÓN BIOTECNOLÓGICA

• Es una enzima de interés clínico, debido a que las personas con la enfermedad de Gaucher tienen una deficiencia de la misma por un fallo en su expresión. La producción de la enzima recombinante tiene el fin de suplir esa deficiencia y mejorar la calidad de vida de los pacientes.

• En Gaucher de tipo I, el tratamiento más eficiente es el de la terapia de reemplazo enzimatico, ejemplos: Cerezyme, Elelyso, VPRIV

• Se produce la enzima a partir de células de mamíferos, de vegetales, etc.

PROCESO DE CLONACIÓN IN SÍLICO

SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS

Se descargó de UnitProt

MEFSSPSREECPKPLSRVSIMAGSLTGLLLLQAVSWASGARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ-

SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS

Se descargó de UnitProt

ATGGAGTTTTCAAGTCCTTCCAGAGAGGAATGTCCCAAGCCTTTGAGTAGGGTAAGCATCATGGCTGGCAGCCTCACAGGATTGCTTCTACTTCAGGCAGTGTCGTGGGCATCAGGTGCCCGCCCCTGCATCCCTAAAAGCTTCGGCTACAGCTCGGTGGTGTGTGTCTGCAATGCCACATACTGTGACTCCTTTGACCCCCCGACCTTTCCTGCCCTTGGTACCTTCAGCCGCTATGAGAGTACACGCAGTGGGCGACGGATGGAGCTGAGTATGGGGCCCATCCAGGCTAATCACACGGGCACAGGCCTGCTACTGACCCTGCAGCCAGAACAGAAGTTCCAGAAAGTGAAGGGATTTGGAGGGGCCATGACAGATGCTGCTGCTCTCAACATCCTTGCCCTGTCACCCCCTGCCCAAAATTTGCTACTTAAATCGTACTTCTCTGAAGAAGGAATCGGATATAACATCATCCGGGTACCCATGGCCAGCTGTGACTTCTCCATCCGCACCTACACCTATGCAGACACCCCTGATGATTTCCAGTTGCACAACTTCAGCCTCCCAGAGGAAGATACCAAGCTCAAGATACCCCTGATTCACCGAGCCCTGCAGTTGGCCCAGCGTCCCGTTTCACTCCTTGCCAGCCCCTGGACATCACCCACTTGGCTCAAGACCAATGGAGCGGTGAATGGGAAGGGGTCACTCAAGGGACAGCCCGGAGACATCTACCACCAGACCTGGGCCAGATACTTTGTGAAGTTCCTGGATGCCTATGCTGAGCACAAGTTACAGTTCTGGGCAGTGACAGCTGAAAATGAGCCTTCTGCTGGGCTGTTGAGTGGATACCCCTTCCAGTGCCTGGGCTTCACCCCTGAACATCAGCGAGACTTCATTGCCCGTGACCTAGGTCCTACCCTCGCCAACAGTACTCACCACAATGTCCGCCTACTCATGCTGGATGACCAACGCTTGCTGCTGCCCCACTGGGCAAAGGTGGTACTGACAGACCCAGAAGCAGCTAAATATGTTCATGGCATTGCTGTACATTGGTACCTGGACTTTCTGGCTCCAGCCAAAGCCACCCTAGGGGAGACACACCGCCTGTTCCCCAACACCATGCTCTTTGCCTCAGAGGCCTGTGTGGGCTCCAAGTTCTGGGAGCAGAGTGTGCGGCTAGGCTCCTGGGATCGAGGGATGCAGTACAGCCACAGCATCATCACGAACCTCCTGTACCATGTGGTCGGCTGGACCGACTGGAACCTTGCCCTGAACCCCGAAGGAGGACCCAATTGGGTGCGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATCACCAAGGACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTACCACCTTGGCCACTTCAGCAAGTTCATTCCTGAGGGCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAAGAACGACCTGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCCGATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGCTCCTCTAAGGATGTGCCTCTTACCATCAAGGATCCTGCTGTGGGCTTCCTGGAGACAATCTCACCTGGCTACTCCATTCACACCTACCTGTGGCGTCGCCAGTGA

VALIDACIÓN

Con Expasy Translate se se tradujo secuencia de nucleótidos a aminoácidos

Con Expasy Lalign se compararon las secuencias de amoniácidos para validar la de nucleótidos

DISEÑO DE PRIMERS

Con OligoCalc se revisaron sus propiedades:

• Tm de 55-65ºC
• Diferencia de Tm menor al 5ºC
• 18-30 pb
• G ó C en el extremo 3'

Forward

ATG GAG TTT TCA AGT CCT TCC AGA GAG

3'

5 '

Tm

58.2 ºC

Reverse

TCA CTG GCG ACG CCA CAG GTA G

3'

5 '

Tm

60.4 ºC

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Observar sentido de traducción en zona MCS y sus enzimas de restricción

Vector pET32

Vector pGEX

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Con NEBcutter saber cuáles enzimas de restricción de región MCS NO cortan la secuencia de nucleótidos

Elegir el buffer óptimo para que ambas enzimas sean 100% activas

Vector pGEX

Vector pET32

• AvaI
• EcoRI

• XhoI
• EcoRI

Buffer: r2.1

Buffer: r2.1

ADAPTADORES

Añadir la secuencia de corte de la enzima en el extremo 5' del primer

Vector pET32

Reverse

Forward

ATG GAG TTT TCA AGT CCT TCC AGA GAG

3'

5 '

• EcoRI:

GAATTC

• AvaI:

TCA CTG GCG ACG CCA CAG GTA G

5 '

CYCGRG

3'

Vector pGEX

Reverse

Forward

• EcoRI:

ATG GAG TTT TCA AGT CCT TCC AGA GAG

3'

5 '

GAATTC

• XhoI:

TCA CTG GCG ACG CCA CAG GTA G

5 '

CTCGAG

3'

CONCLUSIONES

La producción de enzimas recombinantes tiene un alto grado de aplicación en farmacéutica, ya que permiten generar tratamientos que mejoran la calidad de vida de las personas. Comprender los fundamentos de la transcripción y traducción es una herramienta en donde la cretividad es el límite.

REFERENCIAS

• Brumshtein, B., Greenblatt, H. M., Butters, T. D., Shaaltiel, Y., Aviezer, D., Silman, I., Futerman, A. H., & Sussman, J. L. (2007). Crystal Structures of Complexes of N-Butyl- and N-Nonyl-Deoxynojirimycin Bound to Acid β-Glucosidase: INSIGHTS INTO THE MECHANISM OF CHEMICAL CHAPERONE ACTION IN GAUCHER DISEASE*. Journal of Biological Chemistry, 282(39), 29052-29058. https://doi.org/10.1074/jbc.M705005200
• Dvir, H., Harel, M., McCarthy, A. A., Toker, L., Silman, I., Futerman, A. H., & Sussman, J. L. (2003). X-ray structure of human acid-β-glucosidase, the defective enzyme in Gaucher disease. EMBO reports, 4(7), 704-709. https://doi.org/10.1038/sj.embor.embor873
• Massotti, M. (s. f.). Pseudo-Gaucher cells. Recuperado 2 de abril de 2021, de http://atlas.gechem.org/en/component/k2/item/1702-pseudo-gaucher-cells
• Naphatsamon, U., Ohashi, T., Misaki, R., & Fujiyama, K. (2018). The Production of Human β-Glucocerebrosidase in Nicotiana benthamiana Root Culture. International Journal of Molecular Sciences, 19(7). https://doi.org/10.3390/ijms19071972
• Pavan, E., Ormazabal, M., Peruzzo, P., Vaena, E., Rozenfeld, P., & Dardis, A. (2020). CRISPR/Cas9 Editing for Gaucher Disease Modelling. International Journal of Molecular Sciences, 21(9), 3268-3268. https://doi.org/10.3390/ijms21093268
• PDB. (2007). RCSB PDB - 1OGS: Human acid-beta-glucosidase. https://www.rcsb.org/structure/1OGS
• Roeber, D., Achari, A., Manavalan, P., Edmunds, T., & Scott, D. L. (2003). Crystallization and preliminary X-ray analysis of recombinant human acid β-glucocerebrosidase, a treatment for Gaucher’s disease. Acta Crystallographica: Section D (Wiley-Blackwell), 59(2), 343. https://doi.org/10.1107/S0907444902020498
• UniProt. (2018). P04062 (GLCM_HUMAN). P04062 (GLCM_HUMAN). https://www.uniprot.org/uniprot/P04062#

¡GRACIAS!