Carbohidratos R

Análisis de carbohidratos

Dra. Rebeca García

Importancia de los carbohidratos

• Fuente de energía

• Imparten propiedades de textura
• Fibra dietética
• Representan el 70% de la ingesta calórica diaria en la dieta humana
• Contribuyen con otros atributos de los alimentos como cuerpo, viscosidad, capacidad de retención de agua, etc.

Fuente de Carbohidratos

• La mayor parte de la ingesta de carbohidratos proviene de alimentos de origen vegetal.
• ¿Sabes cual es la excepción?

Clasificación de los Carbohidratos

• Simples: Monosacáridos que no pueden hidrolizarse en compuestos más simples.
• Ejemplos: glucosa, fructosa, galactosa y gliceraldehído.

• Compuestos cristalinos solubles en agua

• Clasificación basada en el grupo funcional: cetosa (grupo cetona) y aldosa (grupo aldehído)
• Clasificación basada en el número de C en cada molécula (triosa, tetrosa, pentosa, hexosa, etc.)

Clasificación de los Carbohidratos

• Oligosacáridos
• Polímeros de relativamente bajo peso molecular (MW) que producen monosacáridos al hidrolizarse. Se encuentran ligados covalentemente via enlaces glicosídicos.
• Disacáridos: sacarosa (azúcar de mesa), lactosa (azúcar de la leche) y maltosa (en los cereales).
• Los enlaces pueden ser entre diferentes carbonos de la molécula.

Oligosacáridos distintos de la sacarosa

Estaquiosa

Celobiosa

Maltosa

Lactosa

Verbascosa

Rafinosa

Clasificación de los Carbohidratos

• Polisacáridos
• son moleculas bastante grandes de hasta 420 kDa que estan compuestas de cadenas de monosacáridos.

• El almidón es el único polisacárido que el humano puede digerir.

• HOMOPOLISACARIDOS se incluye a la amilosa y amilopectina, glicógeno y dextrinas.

• HETEROPOLISACARIDOS se incluye a la pectina, hemicelulosa y muchas gomas.

• Importancia en alimentos
• almidón
• celulosa
• pectina

Para el Etiquetado Nutricional – Análisis Proximal -

• ANALISIS PROXIMAL
• Determinación de humedad, ceniza, proteína, lípidos y carbohidratos en los alimentos.
• Carbohidratos generalmente se calculan por diferencia

• Etiquetado Nutricional
• CARBOHIDRATOS TOTALES= Peso del alimento - (proteína cruda, grasa total, humedad y cenizas)
• En muchos casos es necesario conocer también información de componentes específicos (azúcares simples, almidón, fibra, etc).

Preparación de la Muestra

• La purificación de la muestra es necesaria en alimentos debido a las múltiples interferencias y complejidad de la matriz del alimento.

• Remover interferencias.

Preparación de la muestra

De acuerdo con la Norma 051

• Azucares
• Azúcares añadidos
• Azúcares libres
• Hidratos de carbono disponibles

• Monosacáridos se extraen utilizando 80% etanol caliente.
• Homogenizar la muestra, adicionar carbonato de calcio (neutralizar a la muestra) y extraer con solución de etanol al 80%
• Calentar por 30 min cerca de hervir, filtrar y enfriar.
• Si el alimento es muy ácido (algunas frutas) es indispensable agregar el carbonato de calcio para neutralizar al alimento.
• Clarificación con acetato de plomo es utilizada para remover amino ácidos, pigmentos, ácidos orgánicos y otras moléculas pequeñas.

Extracción de Mono y Oligosacáridos

Eliminación de pigmentos

• Los carbohidratos son neutros.
• Los contaminantes generalmente se encuentran con carga.

• Purificación utilizando resinas de intercambio iónico permite remover compuestos con diferentes cargas, ya que los carbohidratos no tienen carga y no se ligan a ellas.

Fase Estacionaria Contiene Aniones

Resinas de Intercambio Iónico

• El tratamiento con resinas catiónicas puede causar la hidrólisis de oligosacáridos además de otras reacciones químicas

• Existen columnas rápidas que utilizan extracción en fase solida estacionaria que también pueden utilizarse

• Resinas de intercambio aniónico (fase sólida tiene cationes) pueden utilizarse para remover ácidos orgánicos de frutas y vegetales

METODOS DE CHOs TOTALES

METODO DE FENOL ÁCIDO SULFURICO

• Reacciona con los azúcares reductores y no reductores para formar furfural, e hidroximetilfurfural (HMF) estos compuestos condensan con fenol
• Leer la reacción en el espectrofotómetro a 490 nm.

METODOS DE CHOs TOTALES

METODO DE FENOL ÁCIDO SULFURICO

• Aplica a todos los azúcares incluyendo oligo y polisacáridos.
• Debe de realizarse una curva estándar utilizando mezclas de azúcares similares a las que se encuentran en mi incógnita.
• Ejemplo: Zanahoria la glucosa y fructosa tienen una relación 1:1.
• Entonces preparo mi estándar en las mismas proporciones.

Determinación de azúcares reductores

• Método Smogyi-Nelson
• Los azúcares reductores son aquellos que son capaces de donar electrones (pueden ser oxidados).
• La oxidación de los azúcares reductores producen un grupo carboxílico.
• Principio: Se basa en la reducción de ion cuproso Cu(II) a ion cúprico Cu (I) por azúcares reductores. El ion Cu (I) reduce un complejo arsenomolybdato, lo que resulta en un color azul intenso que se puede medir espectrofotométicamente a 520 nm.

Métodos para la determinación de carbohidratos específicos: HPLC, GC y Enzimáticos

FASE LAG (latencia)

Métodos de HPLC

• El método de HPLC a remplazado al método de GC en los últimos años debido a que no requiere de derivatización previa de carbohidratos.
• En el método de GC se requiere de la derivatización porque los carbohidratos no son volátiles.
• Cada una de las etapas en el método de GC debe de completarse en un 100%.

Métodos de HPLC

• Cromatografía de intercambio aniónico.
• Los carbohidratos tiene valores de pKa a pH de 12-14.
• Cuando los carbohidratos se ajustan a un pH de 12-14 algunos de sus grupos hidroxilo se ionizan.
• Eluyen de la columna de la siguiente manera:
• Alditoles, monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos.
• Detector electroquímico

Cromatografía de intercambio iónico

INTERCAMBIADORES DE CATIONES SO2H COOH CH2SO3H OH SH PO3H

INTERCAMBIADORES DE ANIONES Grupos amino

Métodos de HPLC

• Cromatografía fase normal
• Fase estacionaria: Polar
• Gel de sílica
• Fase movil: Gradiente que va incrementando polaridad. (Acetonitrilo – Agua).
• Orden de elución:
• Monosacáridos, azúcares alcoholes, disacáridos y oligosacáridos.

Métodos de HPLC

• Cromatografía de intercambio catiónico
• Fase estacionaria (cargada negativamente): Micropartículas esféricas de resinas sulfatadas.
• Fase movil: Agua y acetonitrilo.
• Orden de elución:
• Eluyen en orden desendiente de peso molecular.
• Primero salen los oligosacáridos, seguidos de trisacáridos, disacáridos, monosacáridos y alditoles.

Métodos de HPLC

• Cromatografía fase reversa
• Fase estacionaria: No polar (hidrofóbica).
• Se prepara haciendo reaccionar sílica gel con hidrocarburos alifáticos de 18 carbonos.
• Fase movil: Agua (polar).
• Orden de elución:
• Posee muy mala resolución de picos. Los monosacáridos eluyen al inicio de la corrida como un solo pico.

Cromatografía de partición

• CROMATOGRAFIA EN FASE NORMAL
• Tiene una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar

• CROMATOGRAFIA EN FASE REVERSA
• Tiene una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar

Cromatografía de partición

• Fase reversa – C18

• Fase normal – Silica OH

Cromatografía de particiónFASE NORMAL

Cromatografía de particiónFASE REVERSA

Métodos de HPLC - Detectores

Detector de índice de refracción

• A mayor concentración, mayor es el índice de refracción detectado (relación lineal con la concentración)
• Desventajas: El IR es una propiedad física que varía fácilmente con cambios en presión, temperatura y cambios en el flujo.
• No pueden utilizarce gradientes de elución.
• Como miden la masa, no es sensible a bajas concentraciones.

Métodos de HPLC - Detectores

Detector electroquímico

• Oxida grupos hidroxilo y aldehidos de los carbohidratos.
• Cuando se oxida alguno de estos grupos se produce una señal detectada mediante un electrodo.

Cromatografía de Gases

Método de Cromatografía de Gases (GC)

• Los carbohidratos se deben derivatizar a compuestos que sean volátiles.
• Derivatización:
• Azúcares reductores se reducen a alditoles utilizando borohidrato de sodio.
• Los alditoles se acetilan con anhídrido acético para producir peracetatos de alditol, los cuales pueden someterse a análisis por GC. (son volátiles).
• Etapas críticas (100%): 1. Reducción de los grupos aldehído a alcoholes primarios y 2. Conversión de azúcares reductores en los esteres volátiles de peracetato.

Método de Cromatografía de Gases (GC) - Derivatización -

• Detector de Ionización a la flama (FID) 

Determinación de Glucosa Método de Oxidasa

• La enzima glucosa oxidasa oxida D-glucosa cuantitaivamente a D-glucono-1,5-lactona y el otro producto es peróxido de hidrógeno.

• Carbohidrato + oxígeno -> CHO oxidado + H2O2

FASE LAG (latencia)

Determinación de Glucosa Método de Oxidasa

• Medición del peróxido de hidrógeno que es producido.
• Se emplea una peroxidasa + compuesto incoloro.
• El compuesto incoloro se puede oxidar a un compuesto colorido que se puede medir espectrofotométricamente.
• Este método se conoce como Método glucosa oxidasa-peroxidasa.

• Se utiliza las siguientes oxidasas: glucosa oxidasa para la glucosa y fructosa oxidasa para la fructosa.

• La absorción de oxígeno puede ser medida utilizando un electrodo de oxígeno.

Método glucosa oxidasa-peroxidasa

DETERMINACIÓN DE POLISACÁRIDOS

Almidón

• Después del agua, es el componente más abundante de los alimentos.
• Se encuentra en todas las partes de las plantas.
• Componente principal de cereales y tubérculos.

Determinación de almidón total

• El único método confiable para determinar almidón total se basa en la conversión total de almidón a D-Glucosa mediante enzimas purificadas específicas para almidón y la determinación de la D-glucosa liberada, mediante un método enzimático específico.

• Las amilasas deben de estar purificadas
• No deben contener celulasa, invertasa o sacarosa, o b-glucanasas.
• No debe contener catalasa.
• Método puede no ser cuantitativo para almidones con alto contenido de amilosa o resistentes al ataque enzimático

Ventajas

• Utiliza enzimas específicas lo que hace que el ensayo sea bastante específico, lo que permite la determinación de almidón en una matriz compleja.
• Existen muchos “kits” para el análisis comercial de glucosa.

Problemas

Almidón resistente al ataque enzimático

AR2

AR3

AR4

AR1

• Físicamente inaccesible porque está atrapado en la matriz del alimento.

• Almidón modificado químicamente que se hace menos suceptible a la digestión.

• Retrogradado. El almidón se recristaliza después de la gelatinización de los gránulos de almidón.

• Almidón no cocido.

Diagrama de flujo para la determinación de almidón total y su nivel de gelatinización

Polisacáridos no almidonosos (hidrocoloides y gomas)

• Se utilizan en casi todos los alimentos procesados como aditivos.
• Los polisacáridos de plantas no tienen una estructura uniforme (diferentes monosocarídos la componente).
• Algunos de ellos poseen carga.

Polisacáridos no almidonosos (hidrocoloides y gomas)

Fibra dietética

Clasificación de la fibra dietética según su fermentabilibilidad

La fibra dietética y sus implicaciones en la salud: Diabetes

• La Asociación Americana de Diabetes (ADA) recomienda un consumo de fibra entre 20-35 g/día tanto soluble como insoluble para mantener un mejor control glucémico e insulínico.

• Fracción soluble de la fibra es la más eficaz en el control de la glucemia.

Mecanismo de Acción

• Retraso en el vaciamiento gástrico.
• Disminución en la absorción de glucosa al quedar atrapada por la viscosidad de la fibra y ser entonces menos accesible a la acción de la amilasa pancreática.

La fibra dietética y sus implicaciones en la salud: Diverticulitis

La fibra dietética y sus implicaciones en la salud: Diarrea

• Al perder el equilibrio de la flora bacteriana del intestino, disminuye la cantidad de lactobacilos y bifidobacterias, produciéndose infecciones por gérmenes oportunistas que provocan la diarrea.

• El asociar a la dieta fibra fermentable, esencialmente fructooligosacáridos e inulina, juega un papel importante a la hora de controlar la diarrea.

La fibra dietética y sus implicaciones en la salud: Saciedad, Obesidad

• Una dieta rica en fibra es procesada más lentamente, y la absorción de los nutrientes ocurre en un período de tiempo mayor.
• La comida rica en fibra toma más tiempo en digerirla y permanece por un período más largo en el estómago lo que se traduce en una rápida sensación de saciedad.

La fibra dietética y sus implicaciones en la salud. Estreñimiento

• Incremento de la masa fecal.
• La fibra insoluble, es la que aumenta en mayor grado la masa fecal.
• Las sales biliares y los ácidos grasos de cadena corta también estimulan la motilidad y aceleran el tiempo de tránsito intestinal.

FIBRA DIETETICA. Determinación Analítica