MBC-5-M5-R1

Replicación del DNA

Doris Vela

Empezar

Replicación semiconservativa​

Cada molécula hija tiene una cadena de la molécula original

Modos de replicación​

• Replicación Theta bacterias​
• Replicación en círculo rodante virus, plásmidos bacterianos​
• Replicación lineal eucariotes

ReplicaciónTheta​

Burbuja de replicación​ Horquilla de replicación​ Replicación bidireccional

Replicación en círculo rodante​

El proceso de la replicación​

• Iniciación y Desenrrollamiento del DNA: Involucra la participación de enzimas de reconocimiento en el ADN y la apertura de la doble hélice. La síntesis de la hebra de ADN hija se inicia desde la horquilla de replicación.​

​

• Elongación: La formación de la horquilla de replicación y formación del replisoma (complejo de proteínas asociadas a la horquilla). Una vez que el replisoma se instala en la horquilla este se mueve a lo largo del ADN.​

​

• Terminación: pobremente comprendido, involucra cuando la molecula parental ha sido completamente replicada

DNA

Inicio de la replicación​

No es un proceso al azar​ Siempre inicia en la misma posición/es (orígenes de replicación, oriC)​ ​ Formación de 2 horquillas de replicación (bidireccional)​ ​ Bacterias: 1 solo origen de replicación (ori C)​ ​ Eucariotes: múltiples orígenes de replicación​ Levadura: 300 orígenes de replicación (1 x 40kb)​ Humanos: 20.000 orígenes de replicación (1 x 150 kb)

Iniciación de la replicación y desenrollamiento del DNA en Escherichia coli

Escherichia coli: origen de replicación​

oriC: 245 bp (complejo de origen de replicación)​ 3 copias - motivo de 13 nucléotidos (5′GATCTNTTNTTTT 3´) rica en AT​ 5 copias - motivo de 9 nucleótidos ( 5´TT A/T T A/C CA A/C A 3´)

La doble hélice se abre por presión del stress de torsión de DnaA

1. Formación del Prepriming complex (Proteinas Dna B-helicasa-, Dna C) y unión a la horquilla de replicación. Se forman dos prepriming complex, uno en cada cadena simple (contínua y retrasada)​
2. Liberación Dna C (rol transitorio). Tiene que desprenderse DNAc para que se active la función helicasa de DnaB. ​
3. Dna B helicasa – rompe los pares de bases e incrementa la apertura de la burbuja de replicación-exponiendo un ADN monocatenario y facilitando la unión de las proteinas iniciadoras de la elongación​
4. Cada DnaB activa una Dna G.-primasa (RNA polimerasa)en cada cadena​
5. Posteriormente a la actividad de las helicasa, se unen los SSB (Single Stranded DNA Binding Protein). SSB protegen al ADN de la actividad de las nucleasas y elimina la estructura secundaria del ADN facilitando la actividad de la ADN polimerasa

El iniciador, requerido por la DNA polimerasa para la síntesis de DNA, es suministrado por la proteína DnaG que sintetiza un RNA corto, de unos 11-12 nt, comienza por pppAG y es el que va a ser elongado por la DNA polimerasa. ​ ​ La DnaG (RNA polimerasa) va asociada a la DnaB (helicasa)y dicha asociación da lugar al primosoma: conjunto de proteínas que van a dar lugar a la síntesis del iniciador. ​ ​ DnaG es activada por DnaB para iniciar la síntesis del cebador. Para que Dna B y Dna G se coloquen se requiere Dna A (caso de oriC).

Escherichia coli: origen de replicación​

• En la síntesis de fragmentos de Okazaki hará falta un iniciador por cada fragmento.
• La reacción de cebado de los fragmentos de Okazaki involucra cargar DnaB, para que active a DnaG y se formen los iniciadores, de manera que DnaB tiene 2 funciones importantes: ​

• actividad helicasa y ​

• activar a DnaG. La interacción periódica de DnaB con DnaG puede ser suficiente para cebar los fragmentos de Okazaki. El primosoma para un replicón oriC, consistiría simplemente de DnaB interactuando periódicamente con la primasa.

COLI

DNA Polimerasas de E. coli​

DNA polimerasas tienen múltiples actividades, como polimerización (replicasas, desdoblamiento del ADN, iniciadores de nuevas cadenas, etc)

Funciones de la DNA Polimerasa​

​

• Función de síntesis de polinucleótidos de ADN en dirección 5’ a 3’​

• Función de exonucleasa 3' a 5' : permite remover nucleótidos del extremo 3' de la cadena que ha sido sintetizada. Involucrada en mecanismos de reparación del ADN (proofreading exonucleasa activities, prueba de lectura)​

• Función de exonucleasa 5' a 3' : capaz de remover al menos parte de un polinucleótido que ya sido unido a la cadena molde que la polimerasa esta copiando. Esta función es utilizada durante el proceso que une los discontinuos ADN sintetizados a partir de la cadena retrasada​

La síntesis de ADN es discontinua​

La replicación del ADN avanza de forma continua cuando es sintetizada la cadena líder (5 a 3), pero es discontinua cuando es sintetizada la cadena retrasada (3 a 5), con la formación de los fragmentos de Okazaki​.​ La síntesis de ambas cadenas se realiza simultáneamente

Replicación de la cadena retrasada​

Formación de cebadores (primers)​ Priming of DNA

• La DNA polimerasa no puede sintetizar una nueva cadena a partir de una única cadena de DNA​

• Síntesis de primers para la replicación del DNA​

• Primers son sintetizados con RNA​

En Bacterias: primers son sintetizados por la enzima Primase (gen DnaG, RNA polimerasa no relacionada a la RNA polimerasa de la transcripción)​-Primers sintetizados son 11-12 nucleótidos

PRIMERS

Formación de cebadores (primers)​

Cadena líder: tiene un solo primer en el origen de la replicación​ ​ Cadena retrasada: se sintetizan tantos primers como segmentos de Okazaki​ ​ - Escherichia coli con fragmentos de Okazaki de 1000-2000 n, ​ ​ -En eucariotes los fragmentos de Okazaki son más cortos y la formación de primers es más recurrente.

Formación de cebadores (primers)​ Priming of DNA

- Escherichia coli con fragmentos de Okazaki de 1000-2000 n, c.a. 4000 primers son requeridos para la replicación del genoma. ​ ​ -En eucariotes los fragmentos de Okazaki son más cortos y la formación de primers es más recurrente.

Elongación de la ​ cadena retrasada

Procesos en la burbuja de replicación (E. coli)​

• DnaB Helicasa (11 diferentes helicasas, 5 a 3, 3 a 5). Helicasa migran en ambas direcciones 3 a 5 y 5 a 3. DnaB Helicasa migra 5 a 3. ​

• Primase (DnaG)-DnaB Helicasa complex → Primosoma. La primasa es capturada por la DnaB.​

• La actividad helicasa requieren de energía proveniente de la hidrólisis de ATP​

• Single strand binding proteins (SSBs-proteinas fijadoras de monohebra):evita la reasociación y degradación del ADN​
• SSBs = RPA (proteínas de replicación eucariotes). Cadenas simples de ADN son suceptibles a ataques de nucleasas.​

• DNA polimerasa: síntesis de ADN​

• DNA pol III (dímero) + primosoma= replisoma​

• DNA ligasa​

​

Replisoma

Primase (DnaG) + Helicasa (DnaB) complex → Primosoma DNA pol III (dímero) + primosoma= ​ Replisoma

Replicación cadena retrasada

Procesos en la burbuja de replicación (E. coli)​ cadena retrasada

Unión de los fragmentos de Okazaki (Escherichia coli)

• DNA polimerasa III carece de función exonucleasa 5’a 3’. La síntesis de DNA pol III termina cuando entra en contacto con el primer de RNA. La DNA poll III libera la cadena retrasada y su lugar es tomado por la ADN pol I​

• DNA polimerasa I tiene función exonucleasa 5’a 3’. Esta polimerasa continua la síntesis​

• DNA polimerasa I+ Rnase H remueve el primer de RNA y lo remplazan con DNA​

• DNA ligasa une los pedazos de DNA. Une el enlace de fosfodiester libre en los fragmentos de Okasaki

La Terminación​

La horquilla de replicación corre a lo largo de genomas lineares o circulares​ ​ La replicación es interrumpida si esta choca con una región del genoma en proceso de transcripción​ ​ La horquilla de replicación alcanza el final de una molécula de ADN (cromosoma), o cuando se encuentra con otra horquilla de replicación moviéndose en dirección contraria​ ​ Lo que sucede posteriormente es pobremente conocido

La Terminación en Escherichia coli​

• Diametralmente al oriC se encuentra los replication termini o secuencias de termino denominadas Ter​
• Las Ter son 14 secuencias que interactúan de forma específica con las proteinas Tus (Ter A, Ter B… TerZ)​

• Tus (terminus utilization substances) son proteinas contrahelicasas polares específicas a la secuencia de término.​

• Tus bloquea el paso de la helicasa en una orientación específica

La Terminación en ​ Escherichia coli

Replicación eucariote

Similaridades y Diferencias

con bacteria

• Cromosoma lineal versus cromosoma circular​
• Genoma eucariote tiene múltiples sitios de orígenes de replicación​
• DNA polimerasa eucariota es mucho más lenta en polimerizar (Euc 50n/s; Proc 1000 n/s)​
• Tamaño del replicón 500-5000 nucleótidos​
• ADN eucariote está asociado a histonas, y el ensamblaje de nucleosomas debe suceder inmediatamente después de la replicación

• Similar geometría de replicación (bidireccional, horquillas, burbuja)​

• Análogas proteínas de replicación

Número de puntos de origen de replicación y tamaño del replicón

DNA polimerasas en Eucariotes

DNA polimerasas en Eucariotes

10-15 DNA polimerasas (,,,, etc.)​ ​ DNA polimerasa alfa, delta y épsilon​ ​ DNA polimerasa  (delta): ​ -Replicación de la cadena retrasada​ -Tiene 2 ( 3 ) subunidades​ -Trabaja asociada a proteínas accesorias PCNA (proliferating cell nuclear antigen). PCNA confiere alta productividad/eficacia a la DNA pol ​ -PCNA es funcionalmente equivalente a la subunidad beta de la ADN polimerasa III de E. coli, que mantienen a la polimerasa pegada al templado

DNA polimerasas en Eucariotes

• DNA polimerasa  (alfa): ​

-Involucrada en la iniciación de la elongación​ -4 subunidades​ -actividad primasa y DNA polimerasa​ -Sintetiza primers (10-12 RNA primers) seguidos de desoxynucleótidos​ -Baja eficacia en síntesis de ADN​ -No tiene función exonucleasa 3-5 (proofreading), pero tiene alta fidelidad​ ​

• DNA polimerasa ε (épsilon): ​

- Replicación de la cadena continua ​

DNA polimerasas en Eucariotes

DNA polimerasa alfa: contiene actividad primasa e inicia la síntesis de ADN colocando un primer de RNA seguido de una corta secuencia de ADN.​ ​ Posteriormente que DNA polimerasa alfa ha colocado 30 a 40 nucleótidos, DNA polimerasa delta completa la replicación en la cadena retrasada​ ​ DNA polimerasa épsilon (similar en estructura y función a DNA pol delta) replica la cadena continua​ ​ Otras DNA polimerasas intervienen en reparación, recombinación o en la replicación de organelas

Saccharomyces cerevisiae (levadura): origen de replicación

Structure of a yeast origin of replication

ACS= 11 nucleótidos conservados (ARS consensus sequences)

20 bp

B1

B2

B3

Origin recognition sequence

ARSs (autonomously replicating sequences) 100 a 120 bp -más pequeños que E coli. ​ ​ (ARSs) Subdominios:​ A y B1  secuencia de origen de reconocimiento (40 bp)​ En esta secuencia se une el complejo de origen de reconocimiento (ORCs, origin-recognition complex), un complejo de 6 proteínas. ORC se une al sitio de origen de la replicación y desenrolla el ADN en esta región​ B2  motivo de 13 nucléotidos ​ B3  sitio de unión complejo proteíco ABF1 (ARS binding factor1)

Saccharomyces cerevisiae: origen de replicación​

Melting of the Helix

ORC- Origin recognition complex​

Melted region

ABF1 ARS binding factor 1

La doble hélice se abre por presión del stress de torsión de ABF1

ORC Complejo de 6 proteinas. Análogo a la Dna A en E. coli

La presencia de ABF1 induce a la apertura del ADN​ Una vez abierto B2 se incorporan las helicasas + otras proteinas

Licensing of DNA replication​

Al inicio de G1, los Factores de licenciamiento de la replicación (RFL) que se unen a los sitios de origen de replicación:​ ​ ORC: origin replication complex, actividad ATPasa​ Cdc6 : cell division cycle protein, actividad ATPasa, recarga a MCM​ Cdt1: estimula Cdc6 (un tipo de Cdc)​ MCM: minichromosome maintenance protein, identifica el punto de origen, a Cdc6 y ORC, actividad helicasa​ ​ Este conjunto se denomina pre-replication complex (pre-RC) ​ En cada especie hay diferentes proteinas que constituyen el pre-RC

DNA

Prereplication complex

Licensing of DNA replication

• En fase G1​

Una vez se ha unido ORC, se unen Cdc6 y Cdt1 y permiten el ensamblaje de MCM (Minichromosome maintenance ) que contiene DNA helicasa que desenrrolla el ADN duplex en una pequeña región en el sitio de origen de la replicación​ ​ En fase S​ Se desensamblan Cdc6 y Cdt1

Pre-replication complex​ ORC​ Cdc6 ​ Cdt1​ MCM Pre-iniciation complex:​ Adición de proteínas​ CDK: cyclin-dependent kinases y​ DDK) Dbf4-dependent kinases​ Ensamblaje de Polimerasa alfa y epsilon

Prereplication complex​

HORQUILLA DE REPLICACIÓN EN EUCARIOTES​

DNA pol  sintetizan los primer RNA-DNA al inicio de la cadena líder y al inicio de cada fragmento de Okazaki​ ​ DNA pol : actividad primasa, sintetiza el primer de 8-12 nucleótidos de RNA y añade hasta 30 nucleótidos adicionales​ ​ En la cadena continua es reemplazada por pol DNA épsilon.​ En la cadena discontinua es reemplazada por pol DNA pol  (delta) RPA (replication protein A) SSBs (en procariotes) ​ ​ Helicasa: MCM (Dna B helicasa en procariotes) . ​

​ RFC factor de replicación C cataliza la unión de PCNA al templado de ADN. Se une al expremo 3 y usa ATP para abrir el anillo de las PCNA y englobar al ADN monocatenario. Posteriormente la hidrólisis del ATP libera los RFC​ ​ PCNA proliferating cell nuclear antigen es la proteína que permite el deslizamiento de la polimerasa durante la síntesis

Formación de cebadores (primers)​

En eucariotes:​ ​ La DNA-polimerasa  presenta actividad primasa.​ ​ DNA-polimerasa  sintetiza un RNA-primer de 10-12 nucleótidos.​ ​ DNA-polimerasa  extiende el RNA-primer añadiendo 20 nucleótidos de DNA, frecuentemente en esta extensión se incluyen ribonucleótidos.​ ​ - Después de la formación ARN-DNA primer la síntesis de ADN es continuada por la DNA polimerasa ​ ​

Priming of DNA​

Formación de cebadores (primers)​ Priming of DNA

- Escherichia coli con fragmentos de Okazaki de 1000-2000 n, c.a. 4000 primers son requeridos para la replicación del genoma. ​ ​ -En eucariotes los fragmentos de Okazaki son más cortos y la formación de primers es más recurrente.

¿Cómo el genoma eucariote elimina los primers de RNA de los fragmentos de Okazaki?

La remoción del primer de RNA en c/Okazaki es necesario

DNA polimerasas en eucariotes carece de función exonucleasa 5’-3’

Remoción de los primers de RNA​

FLAP MODEL​​ FEN 1 - DNA pol  (delta) se ubica en la posición 3’ del fragmento de Okazaki con el objetivo de degradar el extremo 5’ del fragmento próximo​ ​ La helicasa rompe los puentes de H que unen al primer híbrido al templado de ADN​ ​ Mientras tanto la DNA polimerasa delta avanza copiando la secuencia del templado libre del primer del fragmento de Okazaki adyacente.​ ​ El flap ( o solapa) que se genera por la acción de la helicasa y de la ADN pol delta puede ser cortado por la FEN 1.​ ​ La FEN puede romper el puente de fosfodiéster en el punto de unión donde la región desplazada se une al duplex de ADN

Remoción de los primers de RNA​

MODELO DE LA Rnase H​ ​ Rnase H puede degradar parte del primer híbrido de RNA-DNA​ ​ Rnase H no puede cortar el puente de fosfo-diéster entre el último ribonucleótido y el adyacente deoxiribonucleótido​ ​ El último ribonucleótido posee un grupo monofosfato en la posición 5 prima ( y no un grupo trifosfato), y entonces puede ser removida por FEN 1.

La Terminación en ​ eucariotes

No hay proteinas Tus, por lo tanto las horquillas de replicación de diferentes eventos se encuentran en una posición al azar en el genoma​ ​ La terminación simplemente involucra la ligación de los extremos de los nuevos polinucleótidos

¿Qué pasa en los telómeros durante ​ la replicación ?

Telomerasa

Telómeros pueden ser extendidos a través de la enzima telomerasa​ Telomerasa: Proteínas + RNA​ Humanos: RNA consiste de 450 nucleótidos ​ 5- ……….CUAACCCUAAC …………….-3​ ​ ​ Minisatélite (humano) 5- TTAGGG-3​ Telomerasa facilita la extensión 3’ de la cadena, al ser usada como cadena molde​ La síntesis de DNA es llevada a cabo por la reversa transcriptasa​ La cadena sintetizada con la telomerasa es rica en G

DNA

¿Qué pasa en los telómeros durante ​ la replicación ?

Inicio de replicación​ Origen de replicación​ ​ Licencing del DNA:​ - Formación del complejo de pre-replicación​ - Formación del complejo de pre-iniciación​ ​ Elongación:​ Unión de pol alfa y síntesis del primer​ Anclaje de PCNA​ Unión de pol delta a la cadena retrasada​ Unión de pol delta a la cadena continua​ ​ Terminación​ Elongación de los telómeros por las telomerasas