DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y FACTORES QUE AFECTAN LA REA

PRACTICA 8

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y FACTORES QUE AFECTAN LA REACCION

BIOQUIMICA BASICA

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EQUIPO 3 Chavarria Gámez Gretel Amayrani García Sánchez Kevin Luna Terán Alejandra Pérez Matus Yael

¿Qué son?

Las enzimas son necesarias para todas las funciones corporales.

Las enzimas son el conjunto de proteínas encargadas de catalizar (disparar, acelerar, modificar, enlentecer e incluso detener) diversas reacciones químicas, siempre que sean energéticamente posibles. Las enzimas son indispensables para la vida y catalizan alrededor de 4000 reacciones químicas conocidas, siempre que sean estables las condiciones de pH, temperatura o concentración química, ya que las enzimas, al ser proteínas, también puden desnaturalizarse y perder su efectividad.

Clasificación y Nomenclatura

El nombre de una enzima suele derivarse del sustrato o de la reacción química que cataliza, con la palabra terminada en -asa. La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha desarrollado una nomenclatura para identificar a las enzimas basada en los denominados Números EC. De este modo, cada enzima queda registrada por una secuencia de cuatro números precedidos por las letras "EC". El primer número clasifica a la enzima según su mecanismo de acción. A continuación se indican las seis grandes clases de enzimas existentes en la actualidad:

INFO

Características

• Acerelan la velocidad de la reacción química.
• Disminuyen la energía de activación.
• NO modifican el cambio neto de energía
• NO forman parte de los productos finales
• NO se desgastan en el proceso, son reutilizables
• Aceleran la llegada al equilibro, pero no varía su posición.

Propiedades

• ESPECIFICIDAD: Las enzimas son muy específicas por el substrato de la reacción que catalizan.
• Están presentes en pequeñas cantidades.
• N sufren alteraciones irreversibles en el curso de la reacción y por lo tanto, cada molécula de enzima puede participar en muchas reacciones individuales.
• No tienen efecto aobre la termodinámica de la reacción.
• Tienen gran poder catalítico.
• Funcionan en soluciones acuosas en condiciones suaves de pH y temperatura.

Composición Química

Compuestas esencialmente de proteínas, (polímeros de aminoácidos). Unen grupos prostéticos que participan en las reacciones enzimáticas. Los grupos prostéticos no son parte de la cadena polipeptídica de la enzima, pueden ser compuestos orgánicos. es una conformación tridimensional muy definida y en muchos casos está muy bien determinada.

Las enzimas unen sus sustratos en los centros activos. El centro activo es un lugar donde la catálisis de la reacción tiene lugar. En las dos figuras de la lisozima mostradas al lado, el panel de la izquierda muestra un carbohidrato, coloreado de verde, unido en el centro activo de la lisozima. El panel de la derecha muestra el centro activo vacío.

INFO

Determinación de la actividad enzimática

La actividad de una enzima describe qué tan rápido ésta cataliza la reacción que convierte un sustrato en producto. La actividad depende en gran medida de las condiciones de la reacción, que estos son: temperatura, pH, concentración de la enzima sustrato.

INFO

Factores que afectan la reacción enzimática

INTERNOS

EXTERNOS

• Concentración de la enzima
• Concentración del sustrato
• pH
• Hormonas

• Temperatura
• Presión
• Inhibidores

Fórmula

Práctica 8

Competencia

Determina la actividad enzimática y algunos factores que pueden afectar la velocidad de reacción.

Equipo, materiales y reactivos

• Centrifuga eléctrica• Baño maría • Espectrofotómetro • 1 pipeta semiautomática de 1000 µl • 2 pipeta semiautomática de 10 µl • Kit de determinación de Glucosa (SPINREACT) • Muestra sanguínea (glucosa en suero) • Ácido clorhídrico diluido • Hidróxido de sodio diluido

• 3 tubos de ensayoen de 13x100 mm • Pipeta Pasteur con bulbo • Vaso de precipitados de 250 ml (para el hielo) • Hielo • 3 celdillas o fotoceldas • Termómetro • Gradilla metálica • Papel parafilm • Marcador indeleble

Fundamento

La glucosa es oxidada por la enzima Glucosa Oxidasa (GOD) en solución acuosa a ácido gluconico y peróxido de hidrogeno. El peróxido de hidrogeno formado reacciona con fenol y 4 aminofenazona en presencia de la enzima peroxidasa (POD), dando un cromógeno de color rosa-rojizo de quinonimina, cuya intensidad es directamente proporcional a la cantidad de glucosa presente en la muestra.

Fundamento del ácido clirhídrico diluido

El ácido clorhídrico (HCl) es un ácido inorgánico altamente corrosivo, que se disocia completamente en agua, el cual es transparente o levemente amarilloso (Merck, 2010). En solución, el HCl presenta una composición azeotrópica del 23%w. Es empleado en el decapado y limpieza de metales en la industria metalúrgica, en la remoción de depósitos e incrustaciones en los sistemas de intercambio de calor, en los procesos de obtención de sílice activada, cloruros metálicos, cloruro de amonio, dióxido de cloro, colorantes nitrogenados, en la acidulación de pozos petroleros, en la neutralización de aguas residuales, en la producción de agua desmineralizada, y para control del pH. Se emplea también en la producción de glucosa a partir de harina de maíz y de glutamato de sodio, y en la preparación de limpiadores domésticos, como el ácido muriático para la limpieza de pisos, baldosas, azulejos, granitos y paredes. En la elaboración de polímeros, encurtido de cueros, en la industria metalúrgica en general, en la industria alimenticia, en la elaboración de medicamentos y cosméticos, además de muchos otros usos. Es clasificado como un ácido altamente irritante.

Fundamento del hidróxido de sodio diluido

El Hidróxido de Sodio es una base fuerte, se disuelve con facilidad en agua generando gran cantidad de calor y disociándose por completo en sus iones, es también muy soluble en Etanol y Metanol. Reacciona con ácidos (también generando calor), compuestos orgánicos halogenados y con metales como el Aluminio, Estaño y Zinc generando Hidrógeno, que es un gas combustible altamente explosivo El Hidróxido de Sodio es corrosivo para muchos metales. Reacciona con sales de amonio generando peligro de producción de fuego, ataca algunas formas de plástico, caucho y recubrimientos En presencia de la humedad del ambiente, el hidróxido de sodio reacciona con el Dióxido de Carbono para generar Carbonato de Sodio. Reacciona con el Monóxido de Carbono bajo presión para dar formato de Sodio, también en presencia de humedad

Metodología

DETERMINACION DE LA GLUCOSA POR METODO ENZIMATICO DE TRINDER MARCA SPINREACT

4.1 ACTIVIDAD ENZIMATICA A TEMPERATURA DE 37° C (Equipo 1 Y 8)

Marcar 3 tubos de ensayo 13 x 100 mm, agregar los reactivos como se observa en la siguiente tabla:

1. Mezclar bien e incubar a 37° C en baño maría durante 10 minutos (Medir constantemente la
2. temperatura).
3. Observar la coloración
4. Leer las absorbancias de la muestra y el patrón a 505 nm, ajustando a cero con el blanco reactivo.
5. El color es estable durante 60 minutos.

NOTA 1 : El volumen se puede incrementar si el aparato requiere volúmenes mayores a 1 ml. NOTA 2: Utilizar el patrón de la temperatura de 37º C para todas las actividades.

4.2 ACTIVIDAD ENZIMATICA EN AGUA FRIA/HIELO (Equipo 2)

Nota : COLOCAR 20 MINUTOS PREVIOS A LA PRÁCTICA PARA ATEMPERAR LOS REACTIVOS

1. Mezclar bien e incubar en un vaso con agua de hielo (medir la temperatura) durante 10 minutos.
2. Observar la coloración.
3. Leer las absorbancias de la muestra y el patrón a 505 nm, ajustando a cero con el blanco reactivo.
4. El color es estable durante 60 minutos.

NOTA: El volumen se puede incrementar si el aparato requiere volúmenes mayores a 1 mL.

Marcar 2 tubos de ensayo 13 x 100 mm, agregar los reactivos como se observa en la siguiente tabla:

4.3 ACTIVIDAD ENZIMATICA A 80°C (Equipo 3)

1. Mezclar bien e incubar a 80° C (Medir constantemente la temperatura) en baño maría durante 10
2. minutos.
3. Observar la coloración.
4. Leer las absorbancias de la muestra y el patrón a 505 nm, ajustando a cero con el blanco de
5. reactivo. El color es estable durante 60 minutos.

NOTA: El volumen se puede incrementar si el aparato requiere volúmenes mayores a 1 ml.

Marcar 2 tubos de ensayo 13 x 100 mm, agregar los reactivos como se observa en la siguiente tabla:

4.4 ACTIVIDAD ENZIMATICA EN MEDIO ÁCIDO (Equipo 4 Y 5)

1. Agregar una gota de ácido clorhídrico, al tubo patrón y problema.
2. Mezclar bien e incubar a baño maría a 37° C en baño maría durante 10 minutos. Observar la
3. coloración.
4. Leer las absorbancias de la muestra y el patrón a 505 nm, ajustando a cero con el blanco reactivo.
5. El color es estable durante 60 minutos.

NOTA: El volumen se puede incrementar si el aparato requiere volúmenes mayores a 1 ml.

Marcar 2 tubos de ensayo 13 x 100 mm, agregar los reactivos como se observa en la siguiente tabla:

4.5 ACTIVIDAD ENZIMATICA EN MEDIO BÁSICO (Equipo 6 Y 7)

1. Agregar una gota de hidróxido de sodio, al tubo patrón y problema.
2. Mezclar bien e incubar a baño maría a 37° C en baño maría durante 10 minutos. Observar la
3. coloración
4. Leer las absorbancias de la muestra y el patrón a 505 nm, ajustando a cero con el blanco de
5. reactivo. El color es estable durante 60 minutos.

NOTA: El volumen se puede incrementar si el aparato requiere volúmenes mayores a 1 ml.

Marcar 2 tubos de ensayo 13 x 100 mm, agregar los reactivos como se observa en la siguiente tabla:

REGISTRO DE RESULTADOS

A continuación, registra los resultados obtenidos en la siguiente tabla

Bibliografía

colaboradores de Wikipedia. (2021, 21 abril). Enzima. Wikipedia, la enciclopedia libre. https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima#Clasificaci%C3%B3n_y_nomenclatura_de_enzimas Factores que afectan la actividad enzimática. (2020). https://uruguayeduca.anep.edu.uy/sites/default/files/inlinefiles/Factores%20que%20afectan%20la%20actividad%20enzim%C3%A1tica.pdf Ramírez, J. M. R. A. A. (2014). Enzimas: ¿qué son y cómo funcionan? Revista Digital Universitaria. https://www.revista.unam.mx/vol.15/num12/art91/ Verdezoto, D. (2014). Enzimas (propiedades). slideshare. https://es.slideshare.net/DianiitaVerdezoto/enzimas-propiedades

Gracias porsu atención

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