F. CINETICA ENZIMATICA

CINÉTICA ENZIMATICA

(Efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción enzimática)

Biologa: María Leticia García Gómez

La cinética enzimática es la rama de la enzimología que estudia los cambios en la velocidad de las reacciones enzimáticos en la función de los diversos factores de medio de reacción. Los factores más importantes son: 1. Concentración de enzima2. Concentración de ligandos (Substratos, productos, inhibidores y activadores) 3. pH, fuerza iónica 4. temperatura. El análisis apropiado de todos estos factores nos conduce a un mayor conocimiento sobre la naturaleza de la reacción enzimática.

1 A

INTRODUCCION:

Manual Lab. Bioquimica UAEM FMed

Así es posible deducir el orden en que substratos y productos dejan a la enzima y la clase de complejos enzima-sustrato y enzima-producto que se forman. De ciertas constantes cinéticas pueden deducirse la concentración intracelular usual de substratos y productos y la dirección fisiológica de la reacción. La cinética de una reacción puede también indicar la forma en que la actividad de la enzima es regulada “in vivo”. Los efectos de variación de pH y temperatura sobre las constantes cinéticas proporcionan información sobre la identidad de los grupos R de aminoácidos del sitio activo. Igualmente un análisis cinético puede conducir a un modelo para una reacción enzimática.

Si una reacción enzimática se lleva a cabo en la presencia de diferentes concentraciones de sustratos manteniendo constantes la concentración de enzima y demás factores del medio es posible observar que la variación de la velocidad inicial aumenta en forma directamente proporcional a la concentración de sustrato hasta alcanzar una velocidad máxima (Vm) y aumentos posteriores en la concentración del sustratos no cambian la velocidad de la reacción. Esto es debido a que las enzimas a diferencia de los catalizadores inorgánicos, llegan a saturar sus sitios activos con el sustrato. Al registrar la velocidad inicial de la reacción obtenida con cada diferente concentración de sustrato se obtiene una curva hiperbólica

Si en la curva obtenida se interpola la mitad de la V max para encontrar la concentración de sustrato correspondiente, se obtiene una constantes característica de cada enzima denominada constante de Michaelis, Km. La curva descrita sigue la ecuación definida por Michaelis mantiene:

Objetivo

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: 1. Explicar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática. 2. De acuerdo a los resultados obtenidos deducir las constantes cinéticas: velocidad máxima y constante de Michaels para el sistema enzimático utilizado.

Material

Reactivos

Aparatos

Urea, buffer fostatos, ureasa, Hgcl, HCl,

Baño Maria a 50 °C

Material vidrio

Metodología

1. Disponer una serie de tubos de ensaye, perfectamente limpios y numerados, como sigue:

1 gota = 0.05 mL

4. Pasar 5 mL. de cada uno de los tubos a un matraz diferentes, numerado igual que el tubo, y agregar a cada uno 5 mL de agua destilada y 2 gotas de rojo de metilo (indicador).

3. Titular el contenido de cada matraz con HCl 0.1N hasta obtener el color canela que indica el punto final de la neutralización.

RESULTADO:

Calcular de la concentración inicial de sustrato en cada tubo: Teniendo en cuenta que la solución de urea es de 0.25 M, cada mL contiene 250 micromolas de urea, por lo tanto:

Micromolas de urea inicial

Calcular del volumen de titulación corregida, VTC: Restar los mililitros de HCl usados para la titulación del blanco, VTB, A los mililitros de HCl usados para cada tubos problemas, VTP (tubos 2 al 6).

Cálculo de la velocidad relativa de reacción en cada tubo: La velocidad relativa estará dada por las micromolas de urea hidrolizada en los 30 minutos de incubación, la cual se calcula multiplicando el valor de titulación corregida en cada tubo (VTC) por 50, ya que cada mL de HCl 0.1 N corresponden a 50 micromolas de urea hidrolizada. Con los datos obtenidos preparar la siguiente tabla para graficarla en papel milimétrico:

EFECTO DEL TIEMPO EN LA VELOCIDAD DE REACCION

Biologa: María Leticia García Gómez

INTRODUCCION

Se estableció por experimentación, como los demás parámetros ya estudiados. Con fines formativos se describe el diseño de un experimento factible con el mismo material y reactivo para valorar la influencia del tiempo (t) en las reacciones enzimáticas.

El efecto del tiempo sobre la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas

Aunque no se hace normalmente en el curso de laboratorio por faltas de tiempo, se estudia ahora que es oportuno y se tienen frescos los conceptos para lograr una mejor comprensión del tema.

Cuando en una reacción enzimática se mantiene en condiciones óptimas todos los factores que la afectan y solo cambia el tiempo de acción de la misma, la transformación de sustratos en productos, aumenta en forma directamente proporcional al tiempo de incubación. Porque al disponer de mayor tiempo, las moléculas de enzimas pueden actuar sobre un número mayor de moléculas de sustrato.

100%

Las enzimas se mantienen en condiciones óptimas .

Objetivo

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: Determinar experimentalmente y explicar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimático

Material

Reactivos

Aparatos

Urea, buffer fostatos, ureasa, Hgcl, HCl,

Baño Maria a 50 °C

Material vidrio

Metodología

Disponer una serie de tubos como sigue:

A los 10 minutos extraer 3 mL de cada tubo y pasarlos a un matraz diferente agregando al matraz que tenia la muestra problema cuatro gotas de bicloruro de mercurio y a ambos dos gotas de rojo de metilo.

Repetir el procedimiento a los 20 y a los 30 minutos, colectando cada muestra en un matraz diferente

Titular en forma acostumbrada los 6 matraces obtenidos, tres del blanco y tres del problema a los 10, 20 y 30 minutos de incubación.

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Resultados:

Obtenga los valores de titulación corregidos a los 10, 20 y 30 minutos. Graficar u moles de la urea hidrolizada contra tiempo en minutos.

Gracias