Taller Histología 2

Instituto de Diversidad Biológica Tropical iBIOTROP

Expositores

Taller de Histología 2

PhD. Diego Cisneros-Heredia

PhD. Vet. Pedro Aponte

PhD. Vet.Francisco Cabrera

Msc. Vet.Gustavo Donoso

Msc. Sofía Barrera

Juan Carlos Sánchez

PhD. Diego Cisneros-Heredia

Perfil

Profesor titular de la USFQ, a cargo del desarrollo del Museo de Zoología y del Hospital de Fauna Silvestre TUERI como director del Instituto de Diversidad Biológica Tropical iBIOTROP. Obtuvo su maestría en Manejo y Monitoreo Ambiental y su PhD en Biogeografía en King’s College London, Reino Unido. Es investigador asociado del Instituto Nacional de Biodiversidad, de Aves&Conservación / BirdLife Ecuador, y del Museo de Historia Natural de Londres. Ha trabajado por más de 20 años desarrollando actividades de investigación, conservación y gestión de la biodiversidad, así como programas de educación ambiental y difusión científica. Ha publicado más de 130 publicaciones científicas entre artículos internacionales, capítulos de libros y libros.

PhD. Pedro Aponte

Perfil

Decano de Veterinaria. Profesor titular de Morfologia funcional en la Escuela de Veterinaria y Biotecnologia animal en el COCIBA. PhD en Biología Celular, Utrecht University. Países Bajos MS. en Reproducción Animal e Inseminación Artificial Universidad Central de Venezuela. Médico Veterinario. Universidad Central de Venezuela. Venezuela. Sus áreas de interés incluyen el estudio de células madre con miras a solucionar problemas reproductivos y patologías en animales domésticos, silvestres y humanos. Para este fin, utiliza herramientas morfológicas, cultivo celular y biología molecular. Así mismo trabaja con el desarrollo líneas de investigación asociadas a la conservación de germoplasma animal y Medicina Regenerativa.

PhD. Francisco Cabrera

Perfil

Medico Veterinario, Magister en Veterinaria con mención a patología en la Universidad Central de Venezuela. Doctorado en Biología de la Salud en la Universidad de Montpelliere. Profesor de Anatomía Veterinaria I, II y III. Histología y embriología veterinaria I y II. Función y disfunción I y II, Fisiología Veterinaria. Colaborador en estudios de Histopatología Lab. Salud Animal IBIOTROP. Intereses: Patología Veterinaria, Ciencias Morfológicas, Biología del Desarrollo, Explotación Sustentable de especies de Fauna Silvestre

Msc. Gustavo Donoso

Perfil

PMe titulé de médico veterinario en la USFQ (Magna Cum Laude) y obtuve mi maestría en criminalística y forense de la Universidad Internacional del Ecuador. Realicé un internado profesional en la Dirección General de Zoológicos de México y en la Universidad Autonóma Metropolitana de México en el área patología anatómica y clínica. Actualmente, me desempeño como profesor a tiempo completo de la USFQ, donde dictó las cátedras de histología, parasitología y técnicas de necropsia a los estudiantes de medicina veterinaria. Dentro de mis funciones también, colaboro con el laboratorio de salud animal del IBIOTROP y el hospital de fauna silvestre Tueri en las áreas de patología diagnóstica, informes patológicos forenses e investigación de enfermedades que aquejan a los animales que atiende el hospital. Gracias a las colaboraciones existentes en esta última área, he publicado artículos de histología descriptiva y patología de fauna silvestre.

Msc. Sofía Barrera

Perfil

Docente en la USFQ en Biología y Genética. . Biotecnóloga graduada en la USFQ. Realicé mi maestría en Microbiología con experiencia en resistencias antimicrobianas y aplicación de técnicas moleculares para su detección. Maestría en desarrollo en Psicopedagogía en la Universidad Internacional del Ecuador. Mi investigacion se han relacionado con resistencia antimicrobiana, técnicas histológicas y tinciones en tejidos de animales. Areas de interes: Biología molecular, microbiología patogénica y de alimentos, resistencias antimicrobianas, Técnicas histológicas. Técnicas docencia.

Biol. Juan Carlos Sánchez

Perfil

Biólogo con experiencia en el estudio de anfibios y reptiles. Realiza su MSc en Ciencias Biológicas en la Universidad Nacional de Colombia donde, es parte del grupo de investigación de Evolución y Ecología de Fauna Neotropical en el Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia ICN y es investigador asociado del Museo de Zoología & Laboratorio de Zoología Terrestre del Instituto iBIOTROP de la Universidad San Francisco de Quito y del Instituto Nacional de Biodiversidad - Ecuador INABIO. Sus investigaciones se relacionan con la evolución, morfología, taxonomía y ecología funcional de anfibios y reptiles de ecosistemas andinos.

Cronograma de actividades Lunes 18 de julio

Cronograma de actividades Martes 19 de julio

Cronograma de actividades Miércoles Jueves Viernes y sábado

Índice

Contenido de Taller Teórico-práctico Histología

Inclusión

Equipo

Corte Micrótomo

Gracias

Tinciones generales

Resolución de casos

1. Inclusión

Tipos de inclusión:

Definición

Los más comunes: - Parafina - Resina Poco comunes: - Celoidina - Nitrocelulosa - Polietilen glicol o poliésteres de ceras

Procedimiento destinado a mantener una muestra en una posición y orientación adecuadas para su corte

Cómo funciona

El órgano o tejido de sumerge en un elemento líquido que, tras polimerizarse o enfriarse se solidifican

Utilidad

Notas:

Mantener las estructuras intactas para poder observarse bien definidas durante su inspección

- La parafina es la más utiliada para procedimientos de tinción - Tanto la parafina como resina, no son hidrosolubles

Inclusión en resina:

1.1 Inclusión en parafina

1.1.1 Materiales para inclusión en parafina

Parafina histológica

Histocassettes

Moldes de acero

Frascos de vidrio

Plancha caliente

Pinzas

Materiales

Vasos de precipitación

Reactivos

1.1.2 Protocolo para inclusión en parafina

Objetivo inclusión: Sumergir tejidos en parafina para inmovilizar

Parafina

Células: Citoplasma

Naturaleza apolar

Naturaleza polar

Proceso de inclusión en parafina

Paso 4

Paso 3

Paso 1

Paso 2

Selección y corte de tejido previamente fijado

Retirar el fijador

Colocar en histocassette y rotular

Deshidratación

+ info

+ info

+ info

+ info

Proceso de inclusión en parafina

Lavado con solución intermediaria

Paso 5

Paso 6

Paso 8

Paso 7

Lavados con solvente intermediario

Lavados con parafina

Dejar enfriar

Montaje en molde

+ info

+ info

+ info

+ info

Protocolo para la inclusión en parafina

PASO 5

PASO 1

step 1

PASO 2

PASO 3

PASO 4

PASO 6

3 lavados de Etanol 100%

Duis autem vel eum iriure dolor in hendrerit in

Lavado con Etanol 95%

Obtención de tejidos u órganos

Sumergir en Etanol 70%

Lavado con Etanol 70%

Lavado con NeoClear

5 min c/u

Notas: - Rotular histocasetes

1 hora

15 min

+info

40 min

10 min

PASO 10

PASO 7

PASo 8

PASO 9

PASO 12

PASO 11

sumergir en parafina 100% (58°C)

Lavado con NeoClear-Parafina 1:2 (58 °C)

2 lavados de NeoClear

Lavado con NeoClear-Parafina 1:1 (58 °C)

Colocar las muestras en los moldes

Lavado con parafina 100% (58°C)

1 hora

5 min c/u

45 min

45 min

Notas:- Usar histocasetes rotulados - Enfriar

1 hora

1.1.3 Problemas frecuentes en la inclusión de parafina

Problemas frecuentes: Inclusión en parafina

Muestra suave

El cubo se desprende del cassette

Tiempo de procesamiento demaciado corto. Repetir inclusión, modificando protocolo

Muy poca parafina en el cassette. Se podría completar la parafina.

Problemas frecuentes: Inclusión en parafina

Muestra con burbujas

La parafina es frágil

Tiempo de inclusión insuficiente, temperatura muy caliente de parafina. O parafina de mala calidad

Parafina inadecuada. Repetir cubo.

Preguntas?

Es hora de un brake...

2. Corte en micrótomo

Corte en micrótomo

2.1 Equipos y materiales para corte en micrótomo

Porta objetos

Baño de flotación

Micrótomo

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Cuchillas

Alto perfil: Cortes más gruesosBajo perfil: Cortes delgados de rutina

El Micrótomo

Instrumento de corte que permite preparar cortes de 0.1 a 100 micras de grosor.

Tipos de micrótomo

Micrótomo de deslizamiento

Micrótomo de congelación

Micrótomo de rotación

Sujeta-muestras fija y cuchilla movil. Cortes de espesor 0.5-60 um

Sujeta-muestras móvil y una cuchilla fija. Cortes de espesor 0.3-60 um

Tipo de micrótomo de rotación. Muestras congeladas, ambiente frío

Tipos de micrótomo

Micrótomo de mano

Ultramicrótomo

Sujeta-muestras móvil y una cuchilla fija. Cortes de espesor 0.3-60 um

Muestra para microscópios electrónicos. Cortes de 10 nm a 15 um

2.2 Protocolo corte en micrótomo

Protocolo corte en micrótomo

Paso 1

Paso 4

Paso 2

Paso 3

Preparación micrótomo

Baño de flotación

Desbaste y corte

Montaje en placa

+ info

+ info

+ info

+ info

Paso 1: Prepación de micrótomo para corte

Para el uso rutinario, las cuchillas desechables están hechas con un ángulo de la faceta de 35° aproximadamente, pero este ángulo puede variar en función del tipo de cuchilla y su fabricante. • Por eso, hay que ajustar, de forma óptima, el ángulo de inclinacióna en función del tipo de cuchilla. • Siga las instrucciones del fabricante del microtomo para el ajuste del ángulo recomendado. Para los portacuchillas Leica se recomienda un ajuste de entre 1° y 5°.

Proceso de corte en el micrótomo de rotación

2.3 Problemas frecuentes en el corte del micrótomo.

Problemas frecuentes: Corte en micrótomo

El tejido se abre en el baño de flotación

Problemas frecuentes: Corte en micrótomo

El tejido se abre en el baño de flotación

Exceso de solvente, extender el tiempo de lavado con parafina. Cambiar la parafina, puede tener una concentración muy alta de solvente.

Problemas frecuentes: Corte en micrótomo

El centro del tejido no está parafinado

Deshidratación insuficiente, o muy poco tiempo en parafina. O tejido muy grande. Volver a procesar

Problemas frecuentes: Corte en micrótomo

El tejido en el cubo está muy rígido. Al cortarlo se observan espacios en blanco grandes

Tejido quemado, exceso de calor en los pasos de lavado de parafina. O se dejó secar el tejido completamente entre pasos. Irreversible. Mojar la cara del cubo con agua helada o agente suavizante.

Problemas frecuentes: Corte en micrótomo

Persianas en parafina tras el corte.

Debido al desgaste de las cuchillas. Cambiar de cuchilla o de punto de contacto de cuchilla con el cubo de parafina.

3. Tincionesgenerales

Naturaleza química de pigmentos

Básicos

Catiónicos, afinidad por estructuras ácidas

Ácidos

Aniónicos. Afinidad por estructuras básicas.

Hidrofóbicos

Tiñen sustancias hidrofóbicas: lípidos.

Pigmentos básicos catiónicos

Safranina

Hematoxilina

Azul de Tuolidina

Pigmentos ácidos aniónicos

Fuscina ácida

Eosina

Naranja G

Pigmentos Hidrofóbicos

Sudan Black

Rojo aceite O

Sudan IV

Pregunta:

¡Eureka!

Podríamos visualizar lípidos, en las placas realizadas con el protocolo de inclusión en parafina que se mencionó taller? Si? No? Qué partes se observarían teñidas si observamos tejido adiposo parafinado?

Las tinciones suelen combinar varios pigmentos contrastantes

Tinción Hematoxilina- Eosina

Hematoxilina (básico)

Núcleo

Título aquí

Eosina(ácido)

Citoplasma

1 min

https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/he-basics-part-4-troubleshooting-he/

Otras tinciones

HE PAS

PAS (Peryodic acid shift)

Tricrómica de Masson

Tinción histoquímicaa (no solo afinididad eléctrica sino modificación química del tejido)

Hematoxilina férrica de Weigert, Fucina ácida, Verde luz 2%

Glúcidos, Glicoproteína, Hidratos de carbono o proteoglicano (Moco, tejido conjuntivo): Fuccia Nucleos: Morados-Azul

Colágeno: Verde-azul Nucleos: Morados Citoplasma: Rosado Músculos: Marrón

Otras tinciones

Inmunohistoquímica

Diff Quick: Citología-Cel. Sanguíneas

4. Problemas de desarrollo en grupo

Caso 1

Hyla cinerea es conocida por tener glándulas secretoras de sustancias lipídicas. Se desea observar la estructura de las mismas y su contenido lipídico. A) ¿Qué protocolo escogería para la inclusión y corte? B) Que tinción utilizaría.

Caso 2

Una veterinaria desea realizar una placa de un exudado de unas heridas que un perro presenta sobre la piel. A) ¿Es aplicable el proceso de inclusión en parafina? B) ¿Qué tipo de tinción utilizaría para visualizar las células epiteliales y el exudado?

Caso 3

En estas imágenes se presenta un corte transversal de colon teñido con Hematoxilina Eosina. En la derecha se encuentra una placa teñida de manera ideal. En nuestro caso tenemos el resultado de la derecha. ¿Qué puede estar sucediendo con la tinción y que podemos hacer para mejorarla?

Caso 4

Un tesista, está realizando cortes histológicos para identificar el efecto de la alimentación en aves, sobre el tejido muscular. Sin embargo sus placas presentan estos pliegues. A) A que se deben estos pliegues, B) ¿Cómo puedo mejorar la técnica? C) ¿Estas placas se pueden recuperar?

Caso 5

Se desea observar un corte de hueso. Sin embargo el hueso al tener calcio es una estructura rígida, dificil de cortar con la cuchilla del micrótomo. A) ¿Qué proceso se puede seguir para cortar este tejido?

• Acido nítrico 5%
• Acido clorhidrico 7%
• Acido fórmico 5%
• EDTA

Recomendable: Muestras frescas

Histología vegetal

ACLARAMIENTO(Anatomía, se deja solo paredes)

INLCUSION

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Hipoclorito de sodio 20 minagua Acido acético 20% - 10 min

FIJACION

BLANQUEADOObservación vasos

Calor? Acido acético-Cromatina Formol al 10% Formol 40% 1ml -acetico glacial 5 ml- alcohol etilico 70% (90 ml)

Método Jeffrey:Acido Nitrico 10% Acidro crómico 10%

Recomendable: Muestras frescas

Histología vegetal

Caso 6

Después de 40 minutos de sacar de Xileno

Un laboratorista se encuentra realizando el protocolo de parafinado. Se olvida calentar la parafina mientras está en el lavado con Xileno (solución antes de parafina) y el tiempo de inmersión en Xileno culmina. Para no tener un exceso de tiempo en el paso en Xileno, decide sacar el cassette del vaso de precipitación y dejarlo afuera hasta que se derrita la parafina. Tras 40 mintos, revisa el tejido y este a cambiado su apariencia. Sin embargo continúa con el proceso de parafinado. A) ¿Habrá un cambio en la morfología del tejido después de realizar un corte? B) ¿Qué hacer en esta situación?

Medida justo después de sacar del Xileno

¡Muchas gracias!

¡Muchas gracias!

¡Eureka!

¡Muchas gracias!

¡Eureka!

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