PRESENTATION TFE

présentation d'un TfE

"ÉTUDE DE L’EXPRESSION DE CCRL2 DANS LA TUMORIGENÈSE"

par BOUHOUT Kawtar

CHABOU RoufaïdaProf.MEKSEM BCT19

Introduction

CCRL2 (récepteur)

• 7 domaines transmembranaires
• Fonctions inconnues

Chémérine (ligand)

• adipocytokine pro-inflammatoire
• favorise la diminution des tumeurs

Objectif

La surexpression de CCRL2 favorise-t-elle la diminution des tumeurs?

Paramètres

Search

4 paramètres, 1 objectif

• Angiogenèse :

si CCRL2 surexprimé ?

• Hypoxie & nécrose :

si CCRL2 surexprimé ?

• [Chémérine]:

si CCRL2 surexprimé ?

Hypoxie

Angiogenèse

Manque d'O2

Nouveaux VS

LoremIpsum

LoremIpsum

Nécrose

[Chémérine]

Ligand de CCRL2

Mort cellulaire

Matériel & Méthodes

Matériel

DatA

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Tumeurs & lignées manipulées

Matériel & Méthodes

Méthodes

ELISA

Western Blot

Immunofluorescence

• QUOI?

Séparer, quantifier des protéines

• POURQUOI?

Quantifier la chémérine

• COMMENT?

SDS-PAGE et Ac spécifiques

• QUOI?

Dosage immunoenzymatique

• POURQUOI?

Quantifier la chémérine

• COMMENT?

Absorbance des échantillons

• QUOI?

Anticorps + fluorochromes in situ

• POURQUOI?

Mesurer l'angiogenèse, hypoxie

• COMMENT?

Marqueurs spécifiques

Immunofluorescence

Méthode: 4 étapes

Marquage des lames: Ac I CD31: ȼ endothéliales

Observation au microscope

INCUBATION 4°C

+ DAPI : noyaux

SÉCHAGE

Ac II : α-SMA (1) : péricytesPimonidazol (2): ȼ hypoxiques

Fixation des tissus tumoraux

Acétone

1e coupe: CD31 + α-SMA 2e coupe : CD31 + Pimonidazol

Western Blot

Méthode: 8 étapes

Transfertsur membrane en nitrocellulose

DÉTECTION par chimiluminescence

Incubation avec Ac I rabbit anti-chemerin

Incubation avec Ac IIanti-rabbit

Électroporèse SDS-PAGE

LAVAGEPBS TWEEN 0,1%

LAVAGEPBS TWEEN 0,1%

BLOCAGElait 5%

ELISA Sandwich

Méthode: 7 étapes

Ajouter l'Ac de détéction

Ajouter l'échantillon

Ajouter le subststrat

Déposer l'anticorps de capture

Mesure de l'absorbance

Lavage

Lavage

INCUBER

INCUBER

INCUBER

Résultats & Discussion

Immunofluorescence Western Blot & ELISA

Graphique 1

Nbre de vaisseaux sanguins + faiblechez LLC CCRL2

WT

CCRL2 naturellement présent

CRISPR-CCRL2

CCRL2 désactivé

-CCRL2

CCRL2 surexprimé

Graphique 2

Hypoxie + faible chez CRISPR CCRL2

Graphique 3

Qté de chémérine pas assez élevée chez B16 CCRL2

Conclusion

Les objectifs sont-ils atteints?

Concentration de chémérine

Résultats non concluants pour ELISA et WB

Angiogenèse

Surexpression de CCLR2 diminue la vascularisation des tumeurs et donc leur croissance

Hypoxie et nécrose

Taux d'hypoxie et de nécrose plus élevé lorsque CCRL2 est surexprimé

Perspectives

(...) Il faudrait utiliser des tumeurs entières et non des coupes de tissus tumorales (...) et trouver un anticorps plus spécifique pour mesurer la quantité de chémerine, l'équipe a pourtant déjà testé de nombreux anticorps et envisage donc de les produire par elle-même (...)

Extrait du TFE p.39 "Conclusion et perspectives"

Merci pour votre écoute!