1 - TP11 ou DM - Antibiogramme

Thème 1 - Génétique

TP 11 ou DM Antibiotiques et résistance bactérienne

Thème 3 - Génétique - TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

En 1928 Alexander Fleming découvre par hasard les antibiotiques avec la pénicilline, qui permet le traitement contre des bactéries. En 1945 il prévient déjà qu’une utilisation trop importante peut entraîner la sélection de souches résistantes à ces mêmes antibiotiques.

1 – Mise en évidence de la résistance bactérienne

2 - Analyse ADN de la souche étudiée

A – Principe de la PCR et de l'électrophorèse sur gel

B – Réalisation de l'électrophorèse sur gel

3 - Etude génétique et origine de la résistance bactérienne

4 - Antibiogramme et recherche de traitements

5 - L'antibiorésistance : un exemple de sélection naturelle

TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

1 – Mise en évidence de la résistance bactérienne

Escherichia coli est la bactérie intestinale la plus commune (80%). On peut aussi la trouver dans de l'eau souillée et certains aliments (notamment crus). Lorsque cette bactérie est responsable d'une infection intestinale, celle-ci se manifeste par des diarrhées parfois accompagnées de douleurs. Généralement un traitement simple suffit. Mais dans 10% des cas, l'infection se complique avec des E. coli entéro-hémorragiques (EHEC). D'autres symptômes peuvent alors apparaître : fièvre, atteinte des reins allant même jusqu'à des anomalies neurologiques centrales (céphalées, convulsions, coma…).

Madame X est admise à l’hôpital avec des symptômes très inquiétants d’EHEC. Un premier traitement aux antibiotiques n'a rien donné. Les médecins cherchent à comprendre pourquoi et recherchent quel(s) antibiotique(s) peuvent être utilisés. L'objectif de ce TP est de comprendre quelques mécanismes de la résistance bactérienne vis à vis des antibiotiques

TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

2 - Analyse ADN de la souche étudiée

Nous voulons savoir si la bactérie présente chez Mme X est résistante ou non à l'antibiotique prescrit. Cette résistance est acquise par mutation. Nous allons réaliser l'analyse de l'ADN de la souche étudiée : après avoir prélevé des bactéries chez Mme X ainsi que des bactéries que l'on sait sensibles ou résistantes à l'antibiotique prescrit, les médecins ont réalisé des PCR afin d’amplifier le fragment d’ADN porteur du gène responsable de la résistance. Ces fragments vont ensuite être traités par une enzyme de restriction : il s'agit d'une méthode de découpe d’ADN basée sur une séquence d'ADN définie. Pour faire une digestion de restriction, on utilise une enzyme qui localise une séquence d’ADN spécifique, généralement de 4 à 8 paires de bases. L'enzyme coupe ensuite l'ADN en deux morceaux. Si une mutation se trouve au milieu d'un des sites de restriction de l’enzyme ; celle-ci n'agira pas. La différence selon que l'ADN a été coupé ou non peut être observée sur un gel d'électrophorèse.

Regarder la vidéo suivante afin de comprendre le principe de la PCR(début => 4min50) et de l’électrophorèse d’ADN sur gel (4min50 => fin) . Résumer en 10 lignes max ces techniques.

PRINCIPE DE LA PCR ET DE L'ELECTROPHORESE sUR GEL

PRINCIPE DE LA PCR ET DE L'ELECTROPHORESE sUR GEL

Structure bactérienne

TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

2 - Analyse ADN de la souche étudiée

Dans ce cas précis, le gène impliqué possède 400 paires de bases, que l'on a amplifié par PCR. Ce produit de PCR a été incubé en présence de l'enzyme de restriction DdeI à 37 ° C.

- l'allèle normal (sensibilité à l'antibiotique) va être coupé en un site précis de sa séquence ADN par l'action de l'enzyme de restriction : on obtient 2 fragments. - l'allèle de résistance à l'antibiotique révèle une mutation (voir partie 3) qui le rend insensible à l'action de l'enzyme de restriction : on obtient 1 seul fragment.

PRotocole pour la realisation DE L'ELECTROPHORESE sUR GEL

Pendant l'électrophorèse : - rédiger votre réponse à la question précédente (principe de l'électrophorèse) - faire la partie 3

Après l'électrophorèse : - présentez et interprétez les résultats - terminer la partie 3 - conclure

Doc-secours si besoin (MDP requis)

Dépôts des échantillons d’ADN sur le gel : Pipetage à la micropipette : - Attention de ne pas planter l'enbout dans le gel !!! - Attention de ne pas relâcher le bouton dans le gel !!!  Puits 1 : 10 µL de marqueur de taille d’ADN  Puits 2: 10 µL de l'échantillon témoin 1 : mélange de bactéries sensibles et résistantes  Puits 3: 10 µL de l'échantillon témoin 2 : mélange de bactéries sensibles et résistantes  Puits 4: 10 µL de l'échantillon bactérie sensible  Puits 5: 10 µL de l'échantillon de Madame X Mise en route de l'électrophorèse : Placez le couvercle sur la cuve à électrophorèse. Assurez-vous que les bornes des électrodes sont bien en place. Vérifiez que de petites bulles se forment près des bornes dans la boîte. Des temps d'électrophorèse plus longs donneront une meilleure résolution de taille. Détermination de la taille des fragments et interprétation : Nettoyer le couvercle orange avec la solution anti-condensation. Si vous utilisez blueGel ™, appuyez simplement sur le bouton de l’illuminateur. Le marqueur de poids doit ressembler approximativement à l'illustration à droite. Prendre en photo le gel. Avec BLUEGEL : placer la chambre noire, permet de prendre facilement une belle photo

Lors de cette manipulation, nous utiliserons évidemment des produits de substitution...

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TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

3 - Etude génétique et origine de la résistance bactérienne

L'antibiotique utilisé sur Mme X est le Céfotaxime. Il s'agit d'un antibiotique de la famille des bêtalactamines, dont le rôle est d'inhiber la production de la paroi bactérienne. En utilisant un logiciel de traitement de séquences ADN (Geniegen2 ), réalisez la comparaison ADN des allèles du gène de la B-lactamase des bactéries afin de mettre en évidence l'origine génétique de la résistance au Céfotaxime. Documents utiles :

Lien :

Capture Libmol montrant une bétalactamase de bactérie résistante (en rose), hydrolyser une molécule de céfotaxime (en jaune).

Cliquez sur les images pour agrandir

TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

4 - Antibiogramme et recherche de traitements

VERSION rapide

version ECE

TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

4 - Antibiogramme et recherche de traitements

1) Expliquez le principe de réalisation d'un antibiogramme et son intérêt médical (10 lignes maxi).

2) En utilisant un logiciel de traitement d'images (Mesurim2), traiter l'antibiogramme de Mme X (image ci-dessous - disponible dans votre dossier-classe) afin de :

Amp

Nal

Pen

Tét

- réaliser les mesures des plages de lyses observées ; - determiner quel est l'antibiotique à utiliser ainsi que la concentration à appliquer en justifiant vos choix.

TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

4 - Antibiogramme et recherche de traitements

1) Expliquez le principe de réalisation d'un antibiogramme et son intérêt médical (10 lignes maxi).

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Thème 3 - Le système immunitaire humain - TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

Pen

Tét

Amp

Nal

4 - Antibiogramme et recherche de traitements

image ci-contre, disponible sur Moodle

et ainsi trouver quel est l'antibiotique à utiliser ainsi que la concentration à appliquer pour guérir mme X en justifiant vos choix.

Thème 3 - Le système immunitaire humain - TP 9 - Antibiotiques et résistance bactérienne

5 - L'antibiorésistance : un exemple de sélection naturelle

Antibiogramme d'une E coli réalisé en 2002 (à gauche) et celui de Mme X, réalisé en 2017 (à droite)

Rappel : principe de l'antibio-gramme

Cliquez sur les images pour agrandir

13 mesures pour lutter contre l'antibiorésistance

A l'aide des documents ci-dessus, justifiez la limitation de l'utilisation déraisonnée des antibiotiques pour lutter contre l'antibiorésistance.

Organisation des passages d'élèves pour les dépots : chaque élève réalise 1 dépôt

Notes perso

Noter les noms pour éventuellement évaluation

Si Kit drépano utilisé : Cory : tube 2 => témoin 1 (S + R) Jacqueline : tube 3 => témoin 2 (S + R) Samuel : tube 4=> témoin 3 (S) Marie: tube 5=> Bactéries de Mme X

Notions à retenir : parmi les mutations spontanées ou induites qui se produisent aléatoirement dans les populations de bactéries, certaines confèrent des résistances aux antibiotiques. L’application d’un antibiotique sur une population bactérienne sélectionne les mutants résistants à cet antibiotique, d’autant plus qu’il élimine les bactéries compétitrices sensibles et permet donc leur développement numérique.

L’utilisation systématique de traitements antibiotiques en santé humaine comme en usage agronomique ou vétérinaire con-duit à augmenter la fréquence des formes résistantes dans les populations naturelles de bac-téries et aboutit à des formes simultanément résistantes à plu-sieurs antibiotiques. Cela constitue un important problème de santé publique car le nombre de familles d’antibio-tiques disponibles est limité. De nouvelles pratiques plus responsables des antibiotiques disponibles doivent donc être recherchées.