Actividad 9 - Cromatografía

Cromatografía Por Afinidad

Daniela Suárez Paula Marroquín Mariana Muñiz Paula Lichtensztejn

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Fundamento

¿Cómo funciona?

Es un método cromatográfico líquido en el que se usa un agente biológico o ligando biomimético para la retención selectiva de compuestos complementarios.

La purificación se logra a través de una interacción bifásica con una de las moléculas (el ligando) inmovilizada a una superficie, mientras que su pareja (el objetivo) está en una fase móvil. La mezcla que contiene el antígeno se filtra lentamente a través de la matriz, y da posibilidades óptimas de interacción.

Se basa en la especificidad biológica de la proteína de interés

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La fase estacionaria suele ser un sólido con el ligando, lo que se conoce como la resina de afinidad.

Parámetros experimentales

Los lineamientos para el buffer son sencillos: la concentración de pH y sal debe ser tal que la unión sea fuerte. Los buffers de carga típicos son PBS, pH 7.4, o 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0.

La forma más común de realizarla en el laboratorio es usando columnas cromatográficas.

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EjEMPLO DE APLICACIÓN

En estudios de glicoproteómica dirigida, la cromatografía por afinidad de lectina en serie fue aplicada para identificar cerca de treinta proteínas de la sangre humana con sitios O-glicosilación. (Durham & Regnier, 2006)

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vENTAJAS

• Se puede utilizar en ingeniería genética.
• Se puede utilizar durante la producción de vacunas.
• Con la cromatografía de afinidad se puede observar un grado muy alto de pureza.
• Alta especificidad con cromatografía de afinidad.

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dESVENTAJAS

• Los ligandos utilizados en la cromatografía de afinidad son caros.
• Se puede presentar una fuga de ligandos
• Adsorción no específica en cromatografía de afinidad.

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simulación

Proteína 8

Permanece estable durante varias horas hasta una temperatura de 40 °C y un valor de pH entre 5.5 y 10.

Eluyentes:

Ligandos:

• 2mM-Tris/HCl, pH 7.4
• 0.2 M glycine/HCl pH 2.3
• 5mM-competitive inhibitor
• 150mM-imidazole, 300mM-NaCl

• Anticuerpos monoclonales inmobilizados
• IgG policlonal inmobilizada
• Inhibidor competitivo inmobilizado
• Agarosa Ni-NTA (nitriotriacético)

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REFERENCIAS

Ana Wallace. (2015). Affinity Chromatography. 5/3/2021, de Science Direct Sitio web: https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology /affinity-chromatography Walker JM. . (2019). Overview of Affinity Purification. 5/3/2021, de Thermo Fisher Scientific Sitio web: https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/protein-biology/protein- biology -learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-affinity-purification.html Marina N. Vassylyeva, Sergiy Klyuyev, Alexey D. Vassylyev, Hunter Wesson. (2017). Efficient, ultra-high-affinity chromatography in a one-step purification of complex proteins. 5/3/2021, de PNAS Sitio web: https://www.pnas.org/content/114/26/E5138 Dan Simpson, Kate Zhao. (2017). Affinity chromatography: general methods. 5/3/2021, de NIH Sitio web: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19892186/ Sagar Aryal. (2016). Affinity Chromatography. 5/3/2021, de Microbiology and Biology Study Notes Sitio web: https://microbenotes.com/affinity-chromatography/ Bio-Rad Laboratories. (2015). Introduction to Affinity Chromatography. 5/3/2021, de Bio-Rad Laboratories Sitio web: https://www.bio-rad.com/es-mx/applications-technologies/introduction-affinity-chromatography?ID=MWHAVG4VY