ELISA

Enzime-Linked Immunosorbent Assay

Es una técnica que combina la especificidad de los anticuerpos con la sensibilidad de una reacción enzimática a través del uso de un conjugado enzimático.

Nos permite medir antígenos (Ag) o anticuerpos (Ac)

• Cualitativa
• Semi-cuantitativa
• Cuantitativa

universidad mayor de san andres facultad de ciencias farmacÉuticas y bioquÍmicas Cátedra de InmunologÍa

ENSAYO INMUNOABSORBENTE LIGADO A ENZIMAS (ELISA)

ELABORADO POR: Int. MAMANI POMA, JHAYLINE LIZETH

Fundamento

Basado en el uso de anticuerpos o antígenos conjugados a una enzima, en el que el conjugado formado tiene actividad inmunológica y enzimática.

FASE SOLIDA

los sitios no saturados Se saturan con albumina sérica bovina o leche murinaga

Se tapizan con el Ag o el Ac de interés

El “conjugado” son anticuerpos unidos a una enzima este se inmoviliza

Se añade sustrato enzimático/cromógeno la cual produce una reacción coloreada que posteriormente es cuantificada por espectrometria.

TIPOS DE ELISA

ELISA directo

ELISA indirecto

ELISA tipo Sándwich

3.1

ELISA tipo Sándwich DAS

3.2

ELISA tipo Sándwich HADAS

ELISA Competitivo

4.1

ELISA Competitivo Directo

4.2

ELISA Competitivo Indirecto

ELISA directo

ELISA indirecto

ELISA tipo Sándwich DAS

(Double Antibody Sandwich)

ELISA tipo Sándwich HADA

(Heterologous Double Antibody Sandwich)

ELISA Competitivo directo

ELISA Competitivo indirecto

Acción enzimática sobre cromógenos.

PROCEDIMIENTO

PASOS GENERALES

Lavado

Dilución de la muestra

PASOS GENERALES

Incubación de la muestra

Sustrato-cromógeno

Lavado

Solución stop

Conjugado

Letura

PREPARACION DE REACTIVOS Y SOLUCIONES

Identificación de pocillos

Buffer de Lavado (Wash) 20X 16X 10X 1X

CalibradorCONTROL(+) CONTROL(-) MUESTRA 1 MUESTRA 2

C1 * V1=C2 * V2

C1= Concentracion del buffer comercialC2= Concentración deseada V1= Vol. del buffer Wash V2= Vol. necesario para el ensayo

ej: V1 = (1X * 30ml)/10X = 3ml de WASH 10X +27mL H2O (d)

Proceso

Dilución de la muestra

CalibradorCONTROL(+) CONTROL(-) MUESTRA 1 MUESTRA 2

Con diluyente de muestras : Tampón fosfato con proteínas estabilizadoras y conservantes.200ul x pocillo

Proceso

Incubación de la muestra

Lavado

Dependiendo del ensayo, habitualmente se realizan entre 3 -6, en cada una de las etapas. En NaClO 0.5% eliminar el exceso con papel abosrbente con la placa boca abajo

El tiempo de incubación es variable, depende del ensayo: ½ - 1 hora cuando se trabaja a 37 ° C

Anticuerpo unido a peroxidasa

Proceso

4 y 5

Conjugado y lavado

Pipetear el conjugado enzimático en cada posillo incubar y lavar

37ºC

H2O2

Proceso

Sustrato cromogeno

OPD

Pipetear cromógeno/sustrato en cada pocillo. A continuación, se incuba la microplaca a durante 15 minutos.

37ºC

Proceso

Lectura

SOLUCION STOP

Realizar la medición de las densidades ópticas

Pipetear de ácido sulfúrico en todos los pozos para detener la reacción enzimática.

Controles y Cut-off (punto de corte)

Cut-off = CN + K del inserto

Cut-off = 0,03+ 0,15

Cut-off = CN + K del inserto

Promedio C(-) : 0,03 Promedio C(+) : 1,75

¡Gracias!